Gap Junctionele intercellulaire communicatie: Een functionele Biomarker om de negatieve gevolgen van de Giftige stoffen en toxines te beoordelen, en gezondheidsvoordelen van Natural Products
Summary
Dit protocol beschrijft een scalpel loading-fluorescerende kleurstof overdracht techniek die intercellulaire communicatie meet door middel van gap junction kanalen. Spleetovergangen intercellulaire communicatie is een belangrijke cellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt onderhouden en verstoring van deze cell signaling heeft nadelige gevolgen voor de gezondheid.
Abstract
Dit protocol beschrijft een scalpel loading fluorescerende kleurstofoverdracht (SL-DT) techniek die intercellulaire communicatie via gap junction kanalen, die een belangrijke intracellulaire proces waardoor weefsel homeostase wordt gehandhaafd meet. Onderbreking van spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) van gifstoffen, toxines, geneesmiddelen, enz. Is gekoppeld aan talrijke nadelige gezondheidseffecten. Veel genetisch bepaalde menselijke ziekten zijn verbonden met mutaties in gap junction genen. De SL-DT techniek is een eenvoudige functionele test voor de gelijktijdige beoordeling van GJIC in een grote populatie van cellen. De bepaling omvat voorspaninrichting cellen met een fluorescente kleurstof door kort verstoren de celmembraan met een scalpel door een populatie cellen. De fluorescerende kleurstof wordt vervolgens door mogen steken gap junction kanalen naar naburige cellen gedurende een bepaalde tijd. De assay wordt vervolgens beëindigd door de toevoeging van formaline aan de cellen. De verspreiding van de fluorescent kleurstof door middel van een populatie van cellen wordt beoordeeld met een epifluorescentiemicroscoop en de beelden worden geanalyseerd met een aantal morfometrische software pakketten die beschikbaar zijn, zoals gratis software pakketten te vinden op het publieke domein. Deze test is ook aangepast voor in vivo studies met weefselcoupes van verschillende organen van de behandelde dieren. Globaal kan de SL-DT assay een groot aantal in vitro farmacologische en toxicologische behoeften te dienen, en kan eventueel aangepast worden voor high throughput opzet systemen met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse om meer monsters te ontrafelen in een kortere tijd.
Introduction
Het algemene doel van deze werkwijze is een eenvoudig uitgebreid en relatief goedkope techniek om de potentiële toxiciteit van verbindingen te beoordelen. Dit is een in vitro benadering die kan worden gebruikt op diverse cellijnen. Standard celbiologie labs uitgerust met epifluorescentie microscopen kunnen onderzoeken met behulp van deze test.
Onze basiskennis van celfuncties is sterk afhankelijk van de in vitro bioassays geweest, en is een essentieel onderdeel in de toxicologische beoordeling van geneesmiddelen, milieuverontreinigende stoffen, en voedsel geboren verontreinigingen worden. Helaas is er geen enkele in vitro bioassay systeem dat volledig kan voldoen aan de eisen voor alle toxicologische evaluaties. Veel in vitro assays zijn ontworpen voor optimale en evaluatie uitgevoerd van een specifieke biochemische of moleculaire eindpunt. Deze worden vaak gecombineerd in een high throughput opgezet om een verstoring van een weerspiegelingbepaalde signaaltransductieroute, zoals oestrogeen-receptor signalering 1. Deze strategie is zeer succesvol geweest, maar het grote aantal signaaltransductie routes betrokken bij genexpressie maakt de taak van het kiezen van een specifieke signaleringsroute vrij complex te beoordelen. Hoge doorzet protocollen worden momenteel ontwikkeld en gebruikt voor het gelijktijdig meten tal signaalwegen, welke benadering aantal beperkingen van enkele assays overwinnen is. Echter, niet alle signaalwegen zijn met succes geïntegreerd in meer omvattende aanpak, plus nieuwe signaalwegen worden voortdurend ontdekt dat verder compliceert dit evaluatieproces. Met behulp van uitgebreide aantallen in vitro benaderingen, met name high-throughput systemen, voor een uitgebreide toxicologische evaluaties zijn ook erg duur en zijn niet bevorderlijk voor de meeste alleenstaande onderzoeker leidde onderzoeksprojecten.
GJIC is een proces tigHTLV gecontroleerd door veranderingen in spanning, calciumconcentratie, pH, redox balans, gereguleerd door de grote intracellulaire signaaltransductie en interacties met membraan en cytoskelet eiwitten 2,3. Aldus kan remming van GJIC tijdens verschillende soorten cellulaire stress, verstoring van verschillende cellulaire functies of verstoringen verschillende signaaltransductiewegen. Een andere benadering voor het gebruik van beperkte signaaltransductie bioassays overwinnen is om te profiteren van de biologische verschijnselen dat vele, zo niet de meeste, signaaltransductiewegen worden verder door coöperatieve intercellulaire signaleringssystemen gemoduleerde doorgangsgat junction kanalen 4-8. Hoewel intercellulaire signalering systemen zijn ook talrijk en onder meervoudige traject controle, de intercellulaire signalering doorgangsgat junction kanalen is uiteindelijk afhankelijk van de kanalen worden geopend, gedeeltelijk gesloten of volledig gesloten. Dit verschaft een eindpunt dat gemakkelijk kan worden gemeten met verschillendein vitro bioassay systemen 7. Gezien het feit dat de homeostatic setpunt van een weefsel vereist open kanalen, het bepalen van het effect van verbindingen op spleetovergangen intercellulaire communicatie (GJIC) is een meer integrale aanpak bij het vaststellen van mogelijke toxische effecten van verbindingen 4,8. In wezen is dit kritieke biologische verschijnsel dat coördineert de verschillende signaaltransductie gebeurtenissen genexpressie controleren speelt maakt een brede beoordeling van toxische effecten. Zo bioassays dat GJIC beoordelen zijn een uitstekend uitgangspunt om de toxische potentieel van verbindingen te evalueren.
De meest uitgebreide technieken om GJIC beoordelen op basis voorladen cellen met een fluorescerende probe en bewaken van de migratie van de kleurstof uit de geladen cel of cellen aan aangrenzende cellen. Technieken om de kleurstof voorspanning betrokken microinjectie 9, schrapen laden 10 en methylesters van de sondes 11 </sup>. Scalpel loading fluorescerende kleurstofoverdracht (SL-DT) methode is een modificatie van het schrapen belasting – kleurstofoverdrachtinhibiterende assay ontwikkeld door El Fouly 10. Plaats van de meer invasieve schrapen, het scalpel laadmethode van dit rapport omvat een zachte rol van een scalpel met een rond mes door een monolaag van cellen die invasieve schade te beperken (Figuur 1). De voordelen van deze techniek zijn de toxicologische beoordeling van een populatie van cellen in plaats van enkele cellen van de micro-injectie assay. Bovendien is de eenvoud van deze test zorgt voor een snelle detectie van meerdere platen in een korte tijd dat de methodes behulp van micro-injectie technieken en technieken die methylesters van fluorescerende probes zijn aanzienlijk tijdrovend en vereisen veel hoger niveau.
Hoewel er geen enkele methode om aan alle behoeften van het bestuderen van GJIC te voldoen; de SL-DT test is een eenvoudige, relatief goedkoop en veelzijdig test die kanvoldoen aan veel van de behoeften aan initiële beoordeling van de toxiciteit van verschillende verbindingen. Belangrijkste voordelen zijn: eenvoud, geen bijzondere noodzaak voor apparatuur of vaardigheden die vereist zijn voor andere werkwijzen zoals microinjectie, fluorescent herstel na fotobleken (FRAP) test en lokale activering van moleculaire fluorescente probe assays, snelle en simultane evaluatie van GJIC in een grote aantal cellen, bevorderlijk voor een hoge doorvoer opstelling met geautomatiseerde fluorescentie microscopie beeldvorming en analyse, en de aanpasbaarheid voor in vivo studies.
Protocol
Representative Results
Discussion
De SL-DT-test is een eenvoudige en veelzijdige techniek in het meten van GJIC, maar er zijn een aantal kritische problemen die moeten worden verwerkt in het ontwerp van de juiste experimentele protocollen. Voor robuuste meting van GJIC de SL-DT-test moet een goede spreiding van de kleurstof LY doorgangsgat verbindingspunten van de cellen. Minimaal moet een voldoende tijd worden gekozen om te verzekeren dat de kleurstof verspreidt via acht of meer rijen cellen van de scalpel beladen cellen in beide richtingen. Ook voor h…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
