Gap Junctional intercellulaire Communication: Un biomarqueur fonctionnelle pour évaluer les effets néfastes des substances toxiques et les toxines, et bienfaits pour la santé des produits naturels

Summary

Ce protocole décrit un colorant technique de transfert de chargement fluorescent scalpel qui mesure la communication intercellulaire par les canaux des jonctions lacunaires. Gap communication intercellulaire jonctionnelle est un processus cellulaire majeur par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue et la perturbation de cette signalisation cellulaire a des effets néfastes sur la santé.

Abstract

Ce protocole décrit un scalpel chargement fluorescent transfert de colorant par la technique (SL-DT) qui mesure la communication intercellulaire par des canaux de jonction d'intervalle, ce qui est un processus important intercellulaire par lequel l'homéostasie tissulaire est maintenue. Interruption de l' écart de jonction communication intercellulaire (GJIC) par des substances toxiques, des toxines, des médicaments, etc. a été liée à de nombreux effets néfastes sur la santé. De nombreuses maladies génétiques humaines basée ont été liées à des mutations dans les gènes des jonctions lacunaires. La technique SL-DT est un test fonctionnel simple pour l'évaluation simultanée de GJIC dans une grande population de cellules. L'essai comprend des cellules de pré-chargement avec un colorant fluorescent en perturbant brièvement la membrane cellulaire avec une lame de scalpel, dans une population de cellules. Le colorant fluorescent est alors autorisé à traverser à travers des canaux de jonction à fente des cellules voisines pendant un temps désigné. L'essai est ensuite terminée par l'addition de formaline aux cellules. La propagation du fluocolorant rescent par une population de cellules est évaluée avec un microscope à épifluorescence et les images sont analysées avec un certain nombre de progiciels morphométriques qui sont disponibles, y compris les logiciels libres trouvés sur le domaine public. Ce test a également été adapté pour les études in vivo en utilisant des tranches de tissu à partir de divers organes des animaux traités. Dans l' ensemble, le dosage SL-DT peut servir un large éventail de besoins pharmacologiques et toxicologiques in vitro, et peut être potentiellement adapté pour haut débit de mise en place des systèmes avec fluorescence automatisé d' imagerie et d' analyse au microscope pour élucider plusieurs échantillons dans un temps plus court.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est de fournir une technique simple, complète et relativement peu coûteux pour évaluer la toxicité potentielle de composés. Ceci est une méthode in vitro qui peut être utilisé dans de multiples lignées cellulaires. Standard des laboratoires de biologie cellulaire équipés de microscopes à épifluorescence peuvent effectuer des recherches en utilisant ce test.

Notre connaissance de base des fonctions cellulaires a été très dépendante de tests biologiques in vitro, et est devenu un élément essentiel dans les évaluations toxicologiques des produits pharmaceutiques, des polluants de l' environnement, et les contaminants alimentaires nés. Malheureusement, il n'y a pas un seul système in vitro dans des essais biologiques qui peuvent globalement répondre aux demandes de toutes les évaluations toxicologiques. Beaucoup des essais in vitro sont conçus et optimisés pour évaluer ainsi que d' évaluer un critère biochimique ou moléculaire spécifique. Ceux-ci sont très souvent combinés dans un haut débit mis en place afin de refléter une perturbation d'uncertaine voie de transduction du signal, comme l' œstrogène-récepteur de signalisation ^1. Cette stratégie a eu beaucoup de succès, mais le nombre étendu de voies de signalisation impliquées dans l'expression des gènes rend la tâche de choisir une voie de signalisation spécifique pour évaluer assez complexe. Hauts protocoles par-mis sont actuellement développés et utilisés pour mesurer simultanément de nombreuses voies de signalisation, qui a été une approche pour surmonter certaines des limites des analyses uniques. Cependant, toutes les voies de signalisation ont été incorporées avec succès dans des approches plus globales, ainsi que de nouvelles voies de signalisation sont constamment découvert que complique encore plus ce processus d'évaluation. Utilisation des numéros de vastes approches in vitro, particulièrement élevé par-mis des systèmes, pour les évaluations toxicologiques complètes sont également très coûteux et ne sont pas propices à la plupart enquêteur unique dirigé des projets de recherche.

GJIC est un tig de processushtly contrôlée par des changements dans la tension, la concentration de calcium, le pH, l' équilibre d'oxydoréduction, réglementées par les grandes voies de signalisation intracellulaire de transduction et les interactions avec la membrane et du cytosquelette protéines ^2,3. Ainsi, l'inhibition de GJIC peut refléter différents types de stress cellulaire, la perturbation des différentes fonctions cellulaires, ou perturbations de différentes voies de transduction du signal. Une autre approche pour surmonter l'utilisation des limitées bioessais de transduction du signal est de tirer profit des phénomènes biologiques que beaucoup, sinon la plupart, les voies de transduction du signal sont en outre modulés par les systèmes coopératifs de signalisation intercellulaires par les canaux des jonctions lacunaires ^4-8. Bien que les systèmes de signalisation intercellulaires sont aussi nombreux et sous contrôle des voies multiples, la signalisation intracellulaire par le biais des canaux de jonction de brèche est finalement fonction des canaux étant ouverts, partiellement fermés, ou complètement fermés. Ceci permet d'obtenir un point d'extrémité qui peut être facilement mesurée en utilisant diversesdans les systèmes d'essais biologiques in vitro ^7. Considérant que le point de consigne homéostatique d'un tissu nécessite des canaux ouverts, déterminer l'effet de composés sur les jonctions lacunaires communication intercellulaire (GJIC) est une approche plus globale pour déterminer les effets toxiques potentiels de composés ^4,8. En substance, ce phénomène biologique essentiel qui joue un rôle central dans la coordination de multiples événements de transduction de signaux contrôlant l'expression génique permet une évaluation générale des effets toxiques. Ainsi, des essais biologiques qui évaluent GJIC sont un excellent point de départ pour évaluer le potentiel toxique des composés.

Les techniques les plus utilisées pour évaluer les étendues GJIC sont basés sur le préchargement des cellules avec une sonde fluorescente, puis de contrôler la migration du colorant à partir de la cellule ou des cellules de charge des cellules adjacentes. Techniques de préchargement le colorant ont impliqué microinjection ^9, gratter chargement ^10, et les esters méthyliques des sondes ¹¹ </sup>. Le transfert de colorant de chargement fluorescent scalpel méthode (SL-DT) est une modification de la charge scrape – dye test de transfert développé par El Fouly ^10. Plutôt que de l'éraflure plus invasive, la méthode scalpel de chargement de ce rapport implique un rouleau doux d'un scalpel avec une lame ronde à travers une monocouche de cellules qui minimisent les dommages invasive (figure 1). Les avantages de cette technique sont l'évaluation toxicologique d'une population de cellules plutôt que des cellules individuelles de l'essai de micro-injection. En outre, la simplicité de ce test permet la détection rapide de multiples plaques en un temps court alors que les méthodes utilisant des techniques et des techniques qui utilisent des esters méthyliques des sondes fluorescentes microinjection sont beaucoup plus de temps et nécessite le niveau de compétence considérablement plus élevé.

Bien qu'il n'y ait pas de méthode unique pour répondre à tous les besoins de l'étude GJIC; le dosage SL-DT est un test simple, relativement peu coûteux et polyvalent qui peutrépondre à de nombreux besoins pour les évaluations initiales des toxicités des différents composés. Les principaux avantages comprennent: la simplicité, aucun besoin particulier de l'équipement ou les compétences qui sont nécessaires pour d'autres méthodes telles que la microinjection, la récupération de fluorescence après photoblanchiment (FRAP) test et activation locale moléculaires essais de sonde fluorescente, une évaluation rapide et simultanée de GJIC dans un grand nombre de cellules, propice à un haut débit mis en place avec la fluorescence automatisé imagerie par microscopie et l' analyse, ainsi que sa capacité d' adaptation pour les études in vivo.

Protocol

Le protocole de cette étude a été approuvée par le Comité d'utilisation des National Institutes of Health Sciences du Japon, qui est l' endroit où les expériences in vivo ont été réalisées, des soins et des animaux pour assurer que les rats ont été traités avec humanité et en tenant compte de la réduction de la souffrance. 1. SL-DT bioessai Seed 3 x 10 5 cellules épithéliales de foie de rat WB-F344 SUR DES 35 diamètre des plaques de culture mm contenant E…

Representative Results

Interruption de GJIC a été largement utilisé comme un biomarqueur pour identifier des composés toxiques au niveau épigénétique non génotoxique de contrôle du gène qui induit des effets néfastes sur la santé 14. Par exemple, les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) sont des contaminants omniprésents dans l'environnement , mais varient dans leurs toxicités épigénétiques en fonction de leurs structures moléculaires 15. Les HAP de faible p…

Discussion

Le dosage SL-DT est une technique simple et polyvalent dans la mesure GJIC, mais il y a plusieurs problèmes critiques qui devraient être pris en compte dans la conception de protocoles expérimentaux appropriés. Pour des mesures robustes de GJIC utilisant le test SL-DT il doit y avoir une bonne répartition de colorant de LY à travers les jonctions lacunaires des cellules. Au minimum, un délai suffisant doit être choisie pour assurer que le colorant se propage par huit ou plusieurs rangées de cellules à partir d…

Materials

WB-F344 rat liver epithelial cells	From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC)	none	Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC
35 mm Culture Plates	Corning	430165
25 cm2 culture flasks	Corning	430639
75 cm2 culture flasks	Corning	430641
D-medium, an Eagles modified medium	ThermoFisher/GIBCO	Formula No. 78-5470EF
fetal bovine serum	ThermoFisher/GIBCO	10437
0.25% trypsin-EDTA	ThermoFisher/GIBCO	15050
phosphate buffered saline	homemade	see below for ingredient cat#'s	137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4
KCl	JT Baker – Mallinckrodt	3040-01
NaCl	JT Baker – Mallinckrodt	3624-05
Na2HPO4	JT Baker – Mallinckrodt	3819–01
KH2PO4	JT Baker – Mallinckrodt	3246-01
Lucifer Yellow CH, lithium salt	Sigma-Aldrich Chemical	L0259
rhodamine-dextran	Sigma-Aldrich Chemical	R9379
1-methylanthracene	Sigma-Aldrich Chemical
phenanthrene	Sigma-Aldrich Chemical	P11409
resveratrol	Sigma-Aldrich Chemical	R5010
D609	Tocris Bioscience	1437
acetonitril	EMD	AX0145-1
37% solution formaldehyde	JT Baker – Mallinckrodt	2106-01
#20 surgical blade	Fine Science Tools Inc.	10317-14
50 mL conical sterile tubes	Thermo scientific	339652
Nikon epifluorescence microscope	Nikon -Mager Scientific	Eclipse TE300
Nikon FITC dichroic cube	Nikon -Mager Scientific	96107
CCD camera	Nikon -Mager Scientific	Nikon Cool Snap EZ CCD
imaging system.	Nikon -Mager Scientific	Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system.
Image J	National Institute of Health	http://imagej.nih.gov/ij/