갭 접합부 세포 간 통신 : 천연 제품의 독성 물질과 독소의 반작용을 평가하기위한 기능성 바이오 마커, 보건 혜택
Summary
이 프로토콜은 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 기술에 대해 설명합니다. 갭 접합부 간 통신은 조직의 항상성을 유지하고이 세포 신호의 중단은 건강에 악영향을 갖고있는 중요한 세포 과정이다.
Abstract
이 프로토콜은 조직의 항상성을 유지하는 중요한 세포 간 과정 간극 결합 채널을 통해 세포 간 통신을 측정하는 메스 로딩 형광 염료 전송 (SL-DT) 기술에 대해 설명합니다. 등 독성 물질, 독소, 약물에 의한 갭 접합부 간 통신 (GJIC)의 중단은 많은 부작용 건강에 미치는 영향에 연결되어 있습니다. 많은 유전자 기반 인간 질병 갭 정션 유전자의 돌연변이에 관련되어있다. SL-DT 방식은 셀의 커다란 집단에서 GJIC의 동시 평가를위한 간단한 분석 기능이다. 분석 간략 세포 집단을 메스 블레이드 세포막을 교란하여 형광 염료와 프리로드 셀을 포함한다. 형광 염료는 그 후 지정된 시간에 대해 인접 셀에 간극 결합 채널을 통해 통과시킨다. 분석 후, 세포에 포르말린을 첨가하여 종료한다. FLUO의 확산세포의 인구를 통해 rescent 염료는 표면 형광 현미경으로 평가되고 이미지가 공개 도메인에서 발견 무료 소프트웨어 패키지를 포함하여 사용할 수있는 형태 계측 학적 소프트웨어 패키지의 수와 분석된다. 이 분석은 또한 처리 된 동물의 다양한 기관에서 조직 조각을 사용하여 생체 내 연구에 적용되고있다. 전반적으로, SL-DT 분석은 시험 관내 약리학 및 독성 요구의 넓은 범위를 제공 할 수 있으며, 잠재적으로 더 짧은 시간에 더 많은 샘플을 명료하게 자동 형광 현미경 영상 분석 높은 처리량 설정 시스템에 적용될 수있다.
Introduction
이 방법의 전체 목표는 화합물의 잠재적 인 독성을 평가하기 위해, 간단하고 비교적 저렴 광범위한 기술을 제공하는 것이다. 이것은 여러 세포주에서 사용할 수있는 시험 관내 접근법이다. 표면 형광 현미경을 갖춘 표준 세포 생물학 연구소는이 분석을 사용하여 연구를 수행 할 수 있습니다.
세포 기능의 우리의 기본 지식은 시험 관내 생물 검정에 크게 의존하고 있으며, 제약, 환경 오염 물질, 식품 태어난 오염 물질의 독성 평가에 필수적인 요소가되고있다. 불행히도, 모든 독성 종합적 평가에 대한 요구를 충족시킬 수있는 단일 관내 생물학적 검정 시스템이 없다. 시험 관내 분석의 많은 설계 및 평가뿐만 아니라 특정의 생화학 적 또는 분자 포인트를 평가하도록 최적화되어있다. 이들은 매우 자주의 섭동을 반영하도록 설정 높은 처리량 결합에스트로겐 수용체 1 신호와 같은 특정 신호 전달 경로. 이 전략은 매우 성공적 이었지만, 유전자의 발현에 관여하는 신호 전달 경로의 수는 광범위한 매우 복잡 평가하는 특정 신호 전달 경로를 선택하는 작업을한다. 높은 처리율 프로토콜은 현재 개발되고 동시에 단일 분석의 한계 중 일부를 극복하기위한 하나의 접근법을왔다 수많은 신호 전달 경로를 측정하기 위해 사용되고있다. 그러나 모든 신호 전달 경로가 성공적으로보다 포괄적 인 접근 방식에 통합되었습니다 더불어 새로운 신호 전달 경로는 지속적으로 더 복잡하게하는이 평가 과정을 발견되고있다. 특히 높은 관통 넣어 시스템, 생체 외 접근법의 광범위한 번호를 사용하여, 포괄적 인 독성 평가도 매우 고가이며 대부분의 한 조사에 도움이되지 않습니다에 대한 연구 프로젝트를 주도했다.
GJIC는 프로세스이다 TIGhtly 멤브레인 및 세포 골격 단백질과 2,3- 주요 세포 내 신호 전달 경로와 상호 작용에 의해 조정 된 전압의 변화에, 칼슘 농도의 pH, 산화 환원의 균형에 의해 제어. 따라서 GJIC의 억제는 다양한 세포 유형의 스트레스, 다른 세포의 기능 장애 또는 다른 신호 전달 경로의 섭동을 반영 할 수있다. 제한된 신호 전달 생물 검정의 이용을 극복하는 또 다른 방법은, 가장 많이있는 경우, 신호 전달 경로는 상기 간극 결합 채널 4-8 통해 협력 세포 내 신호 전달 체계에 의해 다양한 변조되는 생물학적 현상을 활용하는 것이다. 세포 내 신호 전달 체계는 다수의 다중 경로 제어하에 있더라도, 갭 정션 채널을 통해 세포 간 신호 전달은 궁극적으로 부분적으로 또는 완전히 닫힌 개폐되는 채널의 함수이다. 이것은 쉽게 다양한 사용하여 측정 할 수있는 포인트를 제공한다체외 생물 검정 시스템 7인치 조직의 항상성 세트 포인트는 갭 접합부 간 통신에 대한 화합물의 효과를 결정하는 단계, 개방 채널을 필요로 고려 (GJIC)의 화합물 4,8- 잠재적 독성을 결정하는보다 포괄적 인 접근이다. 본질적으로, 유전자 발현을 제어하는 복수의 신호 전달 사건을 조정에서 중심 역할이 중요한 생물학적 현상 독성 효과의 광범위한 평가를 허용한다. 따라서, 생물 검정 GJIC 평가는 화합물의 독성 잠재 성을 평가하는 좋은 출발점이다.
GJIC을 평가하는 데 가장 광범위한 기술이 형광 프로브로 세포를 미리로드 한 후, 인접 셀에로드 된 세포 또는 세포로부터 염색제의 이행을 감시에 기초한다. 염료를 미리로드하는 기술은 프로브 (11)의로드 (10), 및 메틸 에스테르를 긁어, 미세 주입 구를 포함했다 </suP>. 메스로드 – 형광 염료 전송 (SL-DT) 방법은 스크랩 부하의 변형입니다 – 엘 Fouly (10)에 의해 개발 된 전송 분석을 염색. 오히려 더 침습적 스크랩보다,이 보고서의 메스를로드하는 방법은 침략 피해를 최소화 세포 (그림 1)의 단층을 통해 라운드 블레이드와 메스의 부드러운 롤을 포함한다. 이 기술의 장점은 셀보다는 마이크로 인젝션 분석의 단일 세포 집단의 독성 평가한다. 마이크로 인젝션 기술 및 형광 프로브의 메틸 에스테르를 사용하는 기술을 사용하는 방법은 훨씬 많은 시간을 소비하며 상당히 높은 기술 수준을 요구하는 반면 또,이 분석의 단순성 단시간에 다수의 판의 빠른 검출을 허용한다.
GJIC 연구의 모든 필요를 충족하는 단일 방법이 없지만; SL-DT 분석은 할 수있는 단순하고 매우 저렴하고 다양한 분석입니다다양한 화합물의 독성의 초기 평가에 대한 요구의 대부분을 충족. 주요 장점은 다음과 같습니다 : 단순, (FRAP) 분석 및 분자 형광 프로브 분석, 대형의 GJIC의 신속하고 동시 평가 지역의 활성화를 photobleaching에 후 같은 미세 주입, 형광 복구와 같은 다른 방법에 필요한 장비 나 기술에 대한 특별한 필요 생체 내 연구를위한 자동화 된 형광 현미경 영상 분석뿐만 아니라 적응성 높은 처리량 설정에 도움이되는 세포의 수.
Protocol
Representative Results
Discussion
SL-DT 분석은 GJIC을 측정하는 간단하고 다양한 기술이지만, 적절한 실험 프로토콜을 설계 할 때 고려되어야한다 몇 가지 중요한 문제들이있다. SL-DT 분석을 사용하여 GJIC의 강력한 측정을 위해 셀 갭 접합을 통해 LY의 좋은 염료 확산이 있어야합니다. 최소한, 적절한 시간 염료 양방향 메스로드 셀에서 셀의 8 개 이상의 행을 퍼지는 것을 보장하도록 선택되어야한다. 또한, 염료 메스로드 셀에서 이전…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supported by NIEHS grants #R01 ES013268-01A2, and the contents are solely the responsibility of the author and do not necessarily represent the official views of the NIEHS, and supported by CETOCOEN UPgrade project No. CZ.1.05/2.1.00/19.0382.
Materials
| WB-F344 rat liver epithelial cells | From Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao of the University of North Carolina (Chapel Hill, NC) | none | Provided by Drs. J. W. Grisham and M. S. Tsao University of North Carolina-Chapel Hill-NC |
| 35 mm Culture Plates | Corning | 430165 | |
| 25 cm2 culture flasks | Corning | 430639 | |
| 75 cm2 culture flasks | Corning | 430641 | |
| D-medium, an Eagles modified medium | ThermoFisher/GIBCO | Formula No. 78-5470EF | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher/GIBCO | 10437 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | ThermoFisher/GIBCO | 15050 | |
| phosphate buffered saline | homemade | see below for ingredient cat#'s | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2PO4, 2 mM KH2PO4 |
| KCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3040-01 | |
| NaCl | JT Baker – Mallinckrodt | 3624-05 | |
| Na2HPO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3819–01 | |
| KH2PO4 | JT Baker – Mallinckrodt | 3246-01 | |
| Lucifer Yellow CH, lithium salt | Sigma-Aldrich Chemical | L0259 | |
| rhodamine-dextran | Sigma-Aldrich Chemical | R9379 | |
| 1-methylanthracene | Sigma-Aldrich Chemical | ||
| phenanthrene | Sigma-Aldrich Chemical | P11409 | |
| resveratrol | Sigma-Aldrich Chemical | R5010 | |
| D609 | Tocris Bioscience | 1437 | |
| acetonitril | EMD | AX0145-1 | |
| 37% solution formaldehyde | JT Baker – Mallinckrodt | 2106-01 | |
| #20 surgical blade | Fine Science Tools Inc. | 10317-14 | |
| 50 mL conical sterile tubes | Thermo scientific | 339652 | |
| Nikon epifluorescence microscope | Nikon -Mager Scientific | Eclipse TE300 | |
| Nikon FITC dichroic cube | Nikon -Mager Scientific | 96107 | |
| CCD camera | Nikon -Mager Scientific | Nikon Cool Snap EZ CCD | |
| imaging system. | Nikon -Mager Scientific | Nikon NIS-Elements F2.2 imaging system. | |
| Image J | National Institute of Health | http://imagej.nih.gov/ij/ |
Riferimenti
- Rotroff, D. M., et al. Predictive endocrine testing in the 21st century using in vitro assays of estrogen receptor signaling responses. Environ.Sci.Technol. 48 (15), 8706-8716 (2014).
- Axelsen, L. N., Calloe, K., Holstein-Rathlou, N. H., Nielsen, M. S. Managing the complexity of communication: regulation of gap junctions by post-translational modification. Front Pharmacol. 4, 130 (2013).
- Nielsen, M. S., et al. Gap junctions. Compr.Physiol. 2 (3), 1981-2035 (2012).
- Sovadinova, I., et al. Phosphatidylcholine specific PLC-induced dysregulation of gap junctions, a robust cellular response to environmental toxicants, and prevention by resveratrol in a rat liver cell model. PLoS.One. 10 (5), e0124454 (2015).
- Trosko, J. E., Chang, C. C., Travis, C. C. . Biologically Based Methods for Cancer Risk Assessment. , 165-179 (1989).
- Trosko, J. E., Mendelsohn, M. D., Peeters, J. P., Normandy, M. J. . Biomarkers and occupational health: progess and perspectives. , 264-274 (1995).
- Upham, B. L. Role of integrative signaling through gap junctions in toxicology. Curr.Protoc.Toxicol. 47, 2.18:2.18.1-2.18:2.18.18 (2011).
- Vinken, M., et al. Connexins and their channels in cell growth and cell death. Cell.Signal. 18 (5), 592-600 (2006).
- Browne, C. L., Wiley, H. S., Dumont, J. N. Oocyte-follicle cell gap junctions in Xenopus laevis and the effects of gonadotropin on their permeability. Science. 203 (4376), 182-183 (1979).
- El-Fouly, M. H., Trosko, J. E., Chang, C. C. Scrape-loading and dye transfer. A rapid and simple technique to study gap junctional intercellular communication. Exp.Cell Res. 168 (2), 422-430 (1987).
- Wade, M. H., Trosko, J. E., Schindler, M. A fluorescence photobleaching assay of gap junction-mediated communication between human cells. Science. 232 (4749), 525-528 (1986).
- Upham, B. L., et al. Structure-activity-dependent regulation of cell communication by perfluorinated fatty acids using in vivo and in vitro model systems. Environ. Health Perspect. 117 (4), 545-551 (2009).
- Trosko, J. E. Gap junctional intercellular communication as a biological "Rosetta stone" in understanding, in a systems biological manner, stem cell behavior, mechanisms of epigenetic toxicology, chemoprevention and chemotherapy. J. Membr. Biol. 218 (1-3), 93-100 (2007).
- Upham, B. L., Weis, L. M., Trosko, J. E. Modulated gap junctional intercellular communication as a biomarker of PAH epigenetic toxicity: structure-function relationship. Environ.Health Perspect. 106, 975-981 (1998).
- Upham, B. L., et al. Tumor promoting properties of a cigarette smoke prevalent polycyclic aromatic hydrocarbon as indicated by the inhibition of gap junctional intercellular communication via phosphatidylcholine-specific phospholipase. C. Cancer Sci. 99 (4), 696-705 (2008).
- Sai, K., Kanno, J., Hasegawa, R., Trosko, J. E., Inoue, T. Prevention of the down-regulation of gap junctional intercellular communication by green tea in the liver of mice fed pentachlorophenol. Carcinogenesis. 21 (9), 1671-1676 (2000).
- Upham, B. L., Deocampo, N. D., Wurl, B., Trosko, J. E. Inhibition of gap junctional intercellular communication by perfluorinated fatty acids is dependent on the chain length of the fluorinated tail. Int. J. Cancer. 78 (4), 491-495 (1998).
- Trosko, J. E., Tai, M. H., Dittmar, T., Zaenkar, K. S., Schmidt, A. Infections and inflammation: Impacts on oncogenesis. Impacts on Oncogenesis. Contrib Microbiol. , 45-65 (2006).
- Trosko, J. E. Human stem cells as targets for the aging and diseases of aging processes. Med. Hypotheses. 60 (3), 439-447 (2003).
- JE, T. r. o. s. k. o., Dittmar, T., Zaenkar, K. . Stem Cells and Cancer. , 147-188 (2008).
- Osgood, R. S., et al. Polycyclic aromatic hydrocarbon-induced signaling events relevant to inflammation and tumorigenesis in lung cells are dependent on molecular structure. PLoS. One. 8 (6), e65150 (2014).
- Weis, L. M., Rummel, A. M., Masten, S. J., Trosko, J. E., Upham, B. L. Bay or baylike regions of polycyclic aromatic hydrocarbons were potent inhibitors of gap junctional intercellular communication. Environ.Health Perspect. 106 (1), 17-22 (1998).
- Yotti, L. P., Chang, C. C., Trosko, J. E. Elimination of metabolic cooperation in Chinese hamster cells by a tumor promoter. Science. 206 (4422), 1089-1091 (1979).
- Zhao, Y., et al. New caged coumarin fluorophores with extraordinary uncaging cross sections suitable for biological imaging applications. J. Am. Chem. Soc. 126 (14), 4653-4663 (2004).
- Goldberg, G. S., Bechberger, J. F., Naus, C. C. A pre-loading method of evaluating gap junctional communication by fluorescent dye transfer. Biotechniques. 18 (3), 490-497 (1995).
- Ziambaras, K., Lecanda, F., Steinberg, T. H., Civitelli, R. Cyclic stretch enhances gap junctional communication between osteoblastic cells. J.Bone Miner.Res. 13 (2), 218-228 (1998).
