Dette manuskriptet beskriver en myk litografi-baserte teknikk for å konstruere ensartede rekker av tre-dimensjonale (3D) epitelvev med definert geometri som er omgitt av ekstracellulær matriks. Denne metoden er mottagelig for et bredt spekter av celletyper og eksperimentelle sammenhenger og gir mulighet for high-throughput screening av identiske replikater.
The architecture of branched organs such as the lungs, kidneys, and mammary glands arises through the developmental process of branching morphogenesis, which is regulated by a variety of soluble and physical signals in the microenvironment. Described here is a method created to study the process of branching morphogenesis by forming engineered three-dimensional (3D) epithelial tissues of defined shape and size that are completely embedded within an extracellular matrix (ECM). This method enables the formation of arrays of identical tissues and enables the control of a variety of environmental factors, including tissue geometry, spacing, and ECM composition. This method can also be combined with widely used techniques such as traction force microscopy (TFM) to gain more information about the interactions between cells and their surrounding ECM. The protocol can be used to investigate a variety of cell and tissue processes beyond branching morphogenesis, including cancer invasion.
Utviklingen av forgrenede epitelvev, kjent som forgrening morfogenese, reguleres av celle-stammer, fysiske og miljømessige faktorer. I melkekjertlene, forgrening morfogenese er en iterativ prosess der styres kollektivt cellemigrering skaper et tre-lignende arkitektur. Det første trinnet er primære knoppen formasjon fra melkekanalene, etterfulgt av gren initiering og forlengelse 1,2. Invasjonen av grenene i det omkringliggende stroma er forårsaket av den systemiske utgivelsen av steroidhormoner i puberteten. Nye primære knopper deretter starter fra endene av eksisterende grener, og denne prosessen fortsetter å skape en epitelial treet 3. Selv om mange viktige biokjemiske signaler har blitt identifisert, en helhetlig forståelse av celle biologiske mekanismer som styrer dette komplekset utviklingsprosess for tiden mangler. Videre mekanistiske studier på påvirkning av spesifikke signaler er vanskelig å dekonstruere fra opplementer i vivo, som presise tid og rom forstyrrelser og målinger er ofte ikke mulig.
Tre-dimensjonale (3D) dyrkningsteknikker, slik som helhet organkultur, primære organoids, og cellekulturmodeller, er nyttige verktøy for systematisk å undersøke mekanismene bak vev morfogenese 4-6. Disse kan være spesielt nyttig for å bestemme innflytelsen av bestemte faktorer hver for seg, slik som mekaniske krefter og biokjemiske signaler, på en rekke celle atferd, inkludert migrering, proliferasjon og differensiering. 6 Engineered cellekultur modeller, særlig lett gjøre det mulig for forstyrrelse av individuelle celler og deres mikromiljø.
En slik kultur modellen bruker en microfabrication basert tilnærming til ingeniør modell mammary epitelvev med kontrollert 3D-struktur som konsekvent og reproduserbart danner grener som vandrer sammen når indusert med enppropriate vekstfaktorer. Den store fordelen med modellen er evnen til nøyaktig å manipulere og måle effekten av fysiske og biokjemiske faktorer, slik som mønstre av mekaniske påkjenninger, med høy statistisk sikkerhet. Denne teknikken, sammen med beregnings modellering, har allerede blitt brukt for å bestemme de relative bidrag fra fysiske og biokjemiske signaler i veiledning av den normale utvikling av melke epitelvev og andre forgrenede epitel 7-11. Presenteres her er et detaljert protokoll for å bygge disse modell vev, som lett kan utvides til andre typer av celler og ekstracellulær matriks (ECM) geler, og som tjener som en potensiell verktøy for testing av terapeutiske midler.
The protocol described above outlines a method to produce identical epithelial tissues of pre-defined shape, enabling spatial control of the mechanical stress experienced by cells in the tissue. An elastomeric mold is used to create cavities in type I collagen that are then filled with epithelial cells and covered with an additional collagen layer such that cells are completely encapsulated in a 3D collagen matrix environment. Further culture of these tissues and treatment with growth factors to induce branching from the…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis med tilskudd fra NIH (HL118532, HL120142, CA187692), David & Lucile Packard Foundation, Camille & Henry Dreyfus Foundation, og Burroughs Velkommen fondet. ASP ble støttet delvis av en Charlotte Elizabeth Procter honorific Fellowship.
Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
PDMS curing agent | Ellsworth Adhesives | Sylgard 184 | |
Lithographically patterned silicon master | self-made | N/A | |
Plastic weigh boat | Fisher Scientific | 08-732-115 | |
100-mm-diameter Petri dishes | BioExpress | D-2550-2 | |
Ethyl Alcohol 200 Proof | Pharmco-Aaper | 111000200 | Make a 70% EtOH (v:v) solution by mixing with dH2O |
Razor blade | American Safety Razor | 620179 | |
1:1 Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium : Ham’s F12 Nutrient Mixture (DMEM/F12) (1:1) | Hyclone | SH30023FS | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150H | |
10x Hank’s balanced salt solution (HBSS) | Life Technologies | 14185-052 | |
Insulin | Sigma Aldrich | I6634-500MG | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
10X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP399-500 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma Aldrich | 221465-500G | |
Bovine type I collagen (non-pepsinized) | Koken | IAC-50 | |
Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | A-7906 | |
Curved stainless steel tweezers | Dumont | 7 | |
35-mm-diameter tissue culture dishes | BioExpress | T-2881-6 | |
15 mL conical tubes | BioExpress | C-3394-2 | |
1.5 mL Eppendorf Safe-Lock Tube | USA Scientific | 1615-5500 | |
Circular #1 glass coverslips, 15-mm in diameter | Bellco Glass Inc. | Special order | |
0.05% 1X Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
Paraformaldehyde | VWR | 100503-916 | |
Triton X-100 | Perkin Elmer | N9300260 | Detergent |
HGF | Sigma Aldrich | H 9661 | Resuspended in dH2O at 50 mg/mL |
Rabbit anti-mouse FAK antibody | Life Technologies | AMO0672 | |
Goat anti-rabbit Alexa 488 antibody | Life Technologies | A-11034 | |
Adobe Photoshop | Adobe | N/A | Used for color-coding pixel frequency maps. |
FIJI (ImageJ) | NIH | N/A | Free image analysis software used for thresholding, registering, and overlaying images to create a pixel frequency map. The StackReg plugin was used for registering binary images. |