कार्बोहाइड्रेट अपमानजनक एंजाइमों की उच्च throughput स्क्रीनिंग उपन्यास अघुलनशील chromogenic सब्सट्रेट परख किट का उपयोग

Summary

A high-throughput assay for enzyme screening is described. This multiplexed ready-to-use assay kit comprises of pre-chosen Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates and complex Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates. Target enzymes are polysaccharide degrading endo-enzymes and proteases.

Abstract

Carbohydrates active enzymes (CAZymes) have multiple roles in vivo and are widely used for industrial processing in the biofuel, textile, detergent, paper and food industries. A deeper understanding of CAZymes is important from both fundamental biology and industrial standpoints. Vast numbers of CAZymes exist in nature (especially in microorganisms) and hundreds of thousands have been cataloged and described in the carbohydrate active enzyme database (CAZy). However, the rate of discovery of putative enzymes has outstripped our ability to biochemically characterize their activities. One reason for this is that advances in genome and transcriptome sequencing, together with associated bioinformatics tools allow for rapid identification of candidate CAZymes, but technology for determining an enzyme’s biochemical characteristics has advanced more slowly. To address this technology gap, a novel high-throughput assay kit based on insoluble chromogenic substrates is described here. Two distinct substrate types were produced: Chromogenic Polymer Hydrogel (CPH) substrates (made from purified polysaccharides and proteins) and Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates (made from complex biomass materials). Both CPH and ICB substrates are provided in a 96-well high-throughput assay system. The CPH substrates can be made in four different colors, enabling them to be mixed together and thus increasing assay throughput. The protocol describes a 96-well plate assay and illustrates how this assay can be used for screening the activities of enzymes, enzyme cocktails, and broths.

Introduction

Techniques for mining genomes and metagenomes have developed rapidly in recent years, and so have medium- and high-throughput strategies for cloning and expressing recombinant enzymes. Furthermore, bioinformatic resources and associated depositories, such as (CAZy)^1,2 have expanded greatly. However, there are considerable challenges inherent in the exploitation of microbial enzyme diversity for industrial purposes and the empirical determination of enzyme activities has now become a serious bottleneck. For example, it is estimated that, using current methods, we can safely predict the activities of no more than 4% of the proteins within the CAZy database. Although numerous methods are available for monitoring enzyme activities they all have some limitations. Well-established techniques based on chromatography combined with mass spectrometry are available for assessing the oligomeric fragments of glycosyl hydrolase (GH) activities^3,4. However, these approaches are labor intensive and generally low-throughput. Methods based on the measurement of reducing sugars such as the dinitrosalicylic acid⁵ and Nelson-Somogyi⁶ assays are widely used for assessing GH activities. However, these assays have limited throughput and can be prone to side-reactions. Individual chromogenic polysaccharide substrates, such as azurine cross-linked (AZCL) are widely used for determination of enzyme activities, but purchasing all of the substrates separately and manually distributing the substrate powders within the assay plate can be cumbersome and costly⁷.

We have developed a new generation of chromogenic polymer hydrogel (CPH) substrates based on chlorotriazine dyes that, when used in conjunction with a 96-well filter plate, form a high-throughput assay system. Additional Insoluble Chromogenic Biomass (ICB) substrates were developed which provide information about substrate availability within complex polymer mixtures, such as those that exist in lignocellulosic biomass. Each substrate can be produced in one of four colors, and different colored substrates can be combined in a single well. In this protocol is shown that this methodology can be applied to a wide variety of polysaccharides and proteins and the potential for screening GHs, lytic polysaccharide monooxygenases (LPMOs) and proteases. Specific protocols are provided for the use of 96 well plates and representative results illustrate the high efficiency of the CPH and ICB substrate kits as tools for enzyme screening.

One significant advantage of the assay kits described, regardless of the substrate, is that the kits are ready to use within 15 minutes, after the activation step. This eliminates the need for time-consuming assembly of the assay from raw substrate materials as it is the case with some other methods⁷. The CPH and ICB substrates have excellent storage (at least one year at room temperature), pH and temperature stability ⁸ and require no specialized equipment or training. The CPH or ICB assays are based on 96-well filter plate within which the reaction with the enzyme is conducted. If the enzyme is active with a given substrate, soluble dyed oligomers are generated, producing a colored supernatant which can then be filtered into a regular clear-well 96-well plate using a vacuum manifold or a centrifuge ⁸.

The substrates are dyed with chlorotriazine dyes which absorb in the visible spectrum (VIS) range and individual colors (red, blue, yellow and green) can be resolved using linear regression if different CPH substrates of different colors are mixed in a single well, and the enzyme acts on more than one substrate. The resulting plate with the supernatants can be measured using a standard microtiter-plate reader capable of measuring absorbance in the VIS range. Mixing different substrates with different colors in one well increases the throughput of the assay system, to a total of 384 experiments in a 96-well plate (4 different substrates of different colors per well).

CPH substrates provide a valuable tool for assessing the specific activity of an enzyme while ICB substrates are used to evaluate the capacity of an enzyme to digest a component within the context of complex substrate mixtures that enzymes usually encounter within biomass. Although ICB substrates do not provide information about individual enzyme specificities, they are nonetheless useful tools for assessing the commercial performance of enzymes, cocktails or broths.

Protocol

1. एक 96 अच्छी तरह से थाली प्रारूप में CPH substrates के साथ chromogenic परख परख किट थाली के एक्टिवेशन 200 μl सक्रियण समाधान (किट के साथ प्राप्त) प्रत्येक कुएं में, आंदोलन के बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट ऊष्मायन द्वारा पीछा जोड़कर 96 अच्छी तरह से फिल्टर परख किट प्लेट (सामग्री की सूची) (नीला CPH-xylan युक्त) को सक्रिय करें। वर्तमान सक्रियण समाधान निकालने के लिए एक वैक्यूम कई गुना (स्पेसर ब्लॉक के अंदर और किसी भी मानक, एक संग्रह थाली के रूप में पारदर्शी 96 अच्छी तरह से थाली के साथ) का उपयोग वैक्यूम लागू करें। यह भी वैक्यूम कई गुना के बजाय इस कदम के लिए 10 मिनट के लिए 2700 XG पर एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना संभव है। 100 μl बाँझ पानी जोड़कर CPH substrates धो और स्टेबलाइजर दूर करने के लिए वैक्यूम (या केन्द्रापसारक बल) लागू होते हैं। इस चरण को दोहराएँ दो बार और प्लेटों अब उपयोग करने के लिए तैयार हैं। एंजाइम की प्रतिक्रिया नोट: हमेशा बफर शामिलअकेले एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में है और अगर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में संभव पहले से विशेषता एंजाइमों। प्रतिकृति की एक सांख्यिकीय उपयुक्त संख्या का प्रयोग करें। CPH substrates 3.0 पीएच 10.0 के लिए और प्रत्येक कुएं में बफर अंत एंजाइम समाधान की कुल मात्रा 180 μl अधिक नहीं होनी चाहिए के बीच स्थिर रहे हैं। संयंत्र निकालने या संस्कृति शोरबा भी शुद्ध एंजाइम समाधान के बजाय प्रयोग किया जा सकता है। 150 μl 100 मिमी सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 4.5 और परख किट थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 5 μl एंडो -cellulase समाधान (1 यू / मिलीलीटर की एक अंतिम एकाग्रता के लिए) जोड़ें। परख किट प्लेट के नीचे उत्पाद प्लेट (एक स्पष्ट अच्छी तरह से थाली microtiter प्लेट रीडर के साथ संगत) रखो झटकों के दौरान प्रतिक्रिया थाली से किसी भी संभावित रिसाव इकट्ठा करने के लिए। 150 rpm पर एक क्षैतिज प्रकार के बरतन में 30 मिनट के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर परख किट थाली सेते हैं। नोट: ऊष्मायन के दौरान परख किट थाली में प्रतिक्रिया मिश्रण एक सुसंगत और रेप्रो को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैducible नतीजा है। CPH substrates 90 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर रहे हैं। जब CPH substrates के साथ अज्ञात एंजाइम सांद्रता वाले संस्कृति बतख का परीक्षण ऊष्मायन समय 24 घंटा तक की वृद्धि की जानी चाहिए। ध्यान दें कि उचित ऊष्मायन बार एंजाइम (एस) की गतिविधि पर निर्भर करती है, लेकिन सामान्य तौर पर, अगर वहाँ 24 घंटा के भीतर नहीं detectable गतिविधि है, यह संभावना है कि एंजाइम का परीक्षण किया सब्सट्रेट नीचा नहीं होगा। एक सक्रिय एंजाइम घुलनशील chromogenic oligosaccharides है, जो रंग सतह पर तैरनेवाला के रूप में दिखाई दे रहे हैं CPH सब्सट्रेट के अघुलनशील chromogenic polysaccharides अपमानजनक है। साफ उत्पाद प्लेट स्पेसर ब्लॉक के अंदर के साथ वैक्यूम कई गुना अंदर रखें। शीर्ष पर परख किट थाली प्लेस और वैक्यूम (-60 किलो पास्कल की अधिकतम नकारात्मक दबाव) लागू होते हैं। यह भी 10 मिनट के लिए 2700 XG पर एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करना संभव है। ध्यान दें: छानना प्रतिक्रिया उत्पाद के रूप में रंग का oligosaccharides युक्त अब आगे के विश्लेषण 8 के लिए उत्पाद थाली में है </s> अप। पता लगाने और मात्रा का ठहराव जाँच करें कि उत्पाद थाली के प्रत्येक कुएं में तरल पदार्थ की मात्रा लगभग दृश्य निरीक्षण द्वारा एक ही है। नीले CPH-xylan एक प्लेट रीडर का उपयोग के लिए 595 एनएम पर संग्रह थाली के absorbance पढ़ें। जब डेटा विश्लेषण कर रही है, कुओं जहां एक एंजाइम से जोड़ा गया था मूल्यों से बफर केवल नकारात्मक नियंत्रण मूल्यों घटाना। दोहराने कुओं 8 से मतलब मूल्य और साधन की (SEM) के मानक त्रुटि की गणना। 2. एक 96 अच्छी तरह प्रारूप में आईसीबी substrates के साथ chromogenic परख एंजाइम की प्रतिक्रिया 150 μl 100 मिमी सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 4.5 और 5 जोड़े μl 31 यू / एमएल एंडो -xylanase परख किट (अच्छी तरह से फाइनल में एंजाइम एकाग्रता: 1 यू / एमएल) लाल आईसीबी-गेहूं के भूसे से युक्त थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए समाधान । नोट: परख किट प्लेट (96 अच्छी तरह से फिल्टर पीएलआईसीबी substrates युक्त Ates) साहित्य में वर्णित के रूप में निर्मित कर रहे हैं (देखें सामग्री की सूची)। आईसीबी substrates 10.0 करने के लिए 3.0 पीएच के बीच एक पीएच रेंज के साथ बफ़र्स में स्थिर रहे हैं। हमेशा एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में अकेले बफर, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में वाणिज्यिक एंजाइम और प्रतिकृतियां के एक सांख्यिकीय उचित नंबर का उपयोग भी शामिल है। CPH सब्सट्रेट प्लेट की तरह आईसीबी substrates सक्रिय है, लेकिन 100 μl वैक्यूम निस्पंदन या centrifugation द्वारा पीछा पानी के साथ तीन बार धोने से स्टेबलाइजर न निकालें। सब्सट्रेट प्लेट के नीचे उत्पाद थाली रखो झटकों के दौरान सब्सट्रेट थाली से किसी भी संभावित रिसाव इकट्ठा करने के लिए। 25 डिग्री सेल्सियस पर प्रतिक्रिया 2 घंटे के लिए 150 rpm पर झटकों सेते हैं। नोट: एक सक्रिय एंजाइम घुलनशील oligosaccharides है, जो रंग सतह पर तैरनेवाला के रूप में दिखाई दे रहे हैं आईसीबी सब्सट्रेट में अघुलनशील chromogenic polysaccharides अपमानजनक है। आईसीबी substrates 90 डिग्री सेल्सियस तक स्थिर रहे हैं। ऊष्मायन टीIME 24 घंटा तक की वृद्धि की जानी चाहिए ऐसी संस्कृति बतख के रूप में गैर शुद्ध एंजाइमों का उपयोग किया जाता है। उत्पाद प्लेट स्पेसर ब्लॉक के अंदर के साथ वैक्यूम कई गुना अंदर रखें। शीर्ष पर परख किट थाली प्लेस और वैक्यूम (-60 किलो पास्कल की अधिकतम नकारात्मक दबाव) को लागू करने या उत्पाद की थाली के कुएं में परख किट थाली से उत्पाद छानना करने के लिए एक सेंट्रीफ्यूज का उपयोग करें। ध्यान दें: छानना प्रतिक्रिया उत्पाद के रूप में रंग का oligosaccharides युक्त अब आगे के विश्लेषण के लिए 8 संग्रह थाली में है। का पता लगाने और मात्रा का ठहराव जाँच करें कि संग्रह थाली के प्रत्येक कुएं में तरल पदार्थ की मात्रा लगभग दृश्य निरीक्षण द्वारा एक ही है। एक प्लेट रीडर का उपयोग लाल आईसीबी-गेहूं के भूसे के लिए 517 एनएम पर संग्रह थाली के absorbance पढ़ें। जब डेटा विश्लेषण कर रही है – बफर घटाना – कुओं से मूल्यों से केवल नकारात्मक नियंत्रण मूल्यों जहां एक एंजाइमजोड़ा गया। दोहराने कुओं 8 से मतलब मूल्य और साधन की (SEM) के मानक त्रुटि की गणना। नोट: अज्ञात एंजाइमों स्क्रीनिंग के मामले में, हम आदेश एंजाइम की गतिविधि के गतिशील रेंज के बारे में अधिक विस्तृत डेटा प्राप्त करने के लिए एक कमजोर पड़ने श्रृंखला बनाने का सुझाव।

Representative Results

उच्च throughput और इस परख के बहुसंकेतन क्षमता अघुलनशील chromogenic बहुलक (या प्रोटीन) हाइड्रोजेल (CPH) 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेटों में व्यवस्थित substrates पर आधारित है। एंजाइमों के रूप में अच्छी तरह से नकारात्मक नियंत्रण परख किट प्लेट (चित्रा 1 ए) से जुड़ जाते हैं और एंजाइमों इसी एक रंग सतह पर तैरनेवाला (चित्रा 1 बी) के उत्पादन सब्सट्रेट नीचा। बाद प्रतिक्रिया समाप्त हो गया है, सतह पर तैरनेवाला एक स्पष्ट अच्छी तरह से उत्पाद की थाली में स्थानांतरित कर रहा है और absorbance 96 अच्छी तरह प्लेटें (चित्रा 1 सी) के लिए उपयुक्त एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग सीधे मापा जा सकता है। एक खुराक एंजाइम के विभिन्न सांद्रता में xylanase को CPH-arabinoxylan की प्रतिक्रिया का एक उदाहरण (0.00 – 0.75 यू / एमएल) चित्रा -1 में दिखाया गया है जहां कम हो रही एंजाइम एकाग्रता नेत्रहीन मनाया जा सकता है। एक अधिक विस्तृत spectrophotometric क्वांटवर्गीकरण एंजाइम एकाग्रता (चित्रा 1E) बनाम absorbance साजिश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। संकेत तीव्रता एंजाइम गतिविधि से मेल खाती है। परख के reproducibility त्रुटि सलाखों से दिखाया गया है (मतलब की मानक त्रुटि, SEM, तीन प्रतिकृतियां के)। इस परख के reproducibility पर अधिक विस्तृत प्रयोगों कहीं और 8 प्रकाशित कर रहे हैं। चित्रा 1. Xylanase CPH-arabinoxylan। ए) CPH सब्सट्रेट (साथ परख किट प्लेट की एक योजना का उपचार जैसे, CPH-arabinoxylan) बस एंजाइमों 1 और 2 और बफर के अलावा पहले 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट कुओं में लोड -only नियंत्रण (एंजाइम 1 एंडो -xylanase गतिविधि के लिए किया था), ग) वैक्यूम की सहायता Filtrat पर, बी) CPH-arabinoxylan एंजाइम 1 द्वारा की गिरावट एक रंग सतह पर तैरनेवाला का उत्पादनउत्पाद थाली करने में supernatants के आयन, absorbance spectrophotometrically मापा जाता है; डी) उत्पाद प्लेट 100 मिमी में एंडो -β-1,4-xylanase के विभिन्न सांद्रता के साथ 4 अलग अलग रंग में CPH-arabinoxylan के उपचार के बाद प्रतिक्रिया उत्पादों युक्त सोडियम एसीटेट बफर, पीएच 4.5 कमरे के तापमान पर 60 मिनट के लिए;। ई) का उपयोग कर spectrophotometry डी से प्रतिक्रिया उत्पादों की मात्रा का ठहराव यहां यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए क्लिक करें। वहाँ एंजाइम स्क्रीनिंग में इस परख प्रयोग करने के लिए विभिन्न विकल्प हैं। एक विकल्प के लिए एक 96 अच्छी तरह से जांच के लिए अलग polysaccharides, जैसे, अज्ञात गतिविधि के साथ (शुद्ध) एंडो -enzymes की एक छोटी संख्या वाले प्लेट का उपयोग करने के लिए है। इस मामले में परिणाम है जो polysaccharides degrad हैं दिखाएगालक्ष्य एंजाइम द्वारा सक्षम। इस सिद्धांत को दिखाने के लिए, एक एंडो -cellulase 25 डिग्री सेल्सियस पर अलग CPH substrates के खिलाफ जांच की थी। तीन अलग अलग एंजाइम सांद्रता (0.5 यू / एमएल, 1.0 यू / एमएल और 5 यू / एमएल) के 30 मिनट के लिए incubated रहे थे। परिणाम उत्पाद प्लेट (2A चित्रा) में स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है। इस एंडो के लिए उत्पाद चादर -cellulase आपूर्तिकर्ता द्वारा प्रदान xyloglucan (इमली) के लिए पक्ष-गतिविधि, जौ β-glucan, Glucomannan, Birchwood xylan और galactomannan के लिए कम पक्ष-गतिविधि का उल्लेख है। इस के साथ संगत, गतिविधि Cellulase करने के लिए अतिरिक्त CPH-β-glucan (जौ) के खिलाफ पाया गया था, CPH-xyloglucan (इमली), CPH-xylan (Beechwood) और CPH-galactomannan (चित्रा 2 बी) के खिलाफ कम गतिविधि। Glucomannan परीक्षण नहीं किया गया था। पिछले की तुलना में एक ही परिस्थितियों में सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है: एक ही CPH substrates वाणिज्यिक उपलब्ध एंजाइमों (0.1 यू / एमएल, 0.5 यू / एमएल और 1.0 यू / एमएल तीन अलग-अलग एंजाइम सांद्रता) के साथ पचा रहे थेप्रयोग। सभी substrates सकारात्मक नियंत्रण एंजाइम द्वारा अपमानित किया गया और संकेत तीव्रता उच्च एंजाइम एकाग्रता (चित्रा 2 सी) के लिए इसी वृद्धि हुई है। चित्रा 2. आठ अलग CPH substrates, 30 मिनट। ए) एक एंडो -cellulase के साथ पचा अलग CPH substrates के उत्पाद थाली के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर आंदोलन के तहत incubated रहे थे अलग सांद्रता में। बी) गतिविधि और के विभिन्न पक्ष गतिविधि की मात्रा एंडो -cellulase। । ई LAMSE और CPH-pachyman, CPH-curdlan, CPH-; त्रुटि सलाखों तीन प्रतिकृतियां सी) इसी CPH सब्सट्रेट (इंडो-Cellulase और 2-HE-सेल्यूलोज करने के लिए विभिन्न व्यावसायिक एंजाइमों की गतिविधि के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व β-glucan (जौ), ई-XYAN4 और CPH-xylan, ई-XEGP और सी.पी.एच-xyloglucan, ई-BLAAM और CPH-amylose, ई-BMACJ और CPH-galactomannan; Megazyme से सभी एंजाइमों)। त्रुटि सलाखों दो प्रतिकृतियां के मतलब की मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। अघुलनशील chromogenic बायोमास (आईसीबी) substrates chromogenic सब्सट्रेट प्रदर्शनों की सूची के लिए एक उपयोगी इसके अतिरिक्त, क्योंकि वे भाग में संयंत्र सेल दीवारों जो बायोमास के प्रमुख घटक हैं polysaccharides के प्राकृतिक व्यवस्था बनाए रखने के लिए कर रहे हैं। CPH और आईसीबी substrates जब तरल माध्यम में खेती Phanerochaete chrysosporium की स्रावित एंजाइमों का विश्लेषण करने के लिए हमारे उदाहरण में उपयोग किया जाता है। परख किट थाली की प्लेट सेटअप 19 CPH substrates और 5 आईसीबी substrates (प्रत्येक सब्सट्रेट, चित्रा 3 बी के लिए 4 कुओं) के साथ चित्रा 3 ए में दिखाया गया है, पी। chrysosporium cultivat थातीन दिनों के लिए एड और फिर सतह पर तैरनेवाला संस्कृति का विश्लेषण किया। इसलिए, 125 μl 200 मिमी बफर प्रत्येक अच्छी तरह से और 25 μl संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के लिए स्थानांतरित किया गया था जोड़ा। तीन अलग अलग पीएच की स्थिति सोडियम एसीटेट बफर पीएच 4.0, सोडियम फॉस्फेट बफर पीएच 6.0 या 8.0 पीएच (चित्रा -3 सी) का उपयोग कर परीक्षण किया गया है। थाली 2 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस पर मिलाते (150 आरपीएम) incubated था। प्रतिक्रिया उत्पादों उत्पाद प्लेट (चित्रा 3 डी) को स्थानांतरित कर दिया गया और विश्लेषण किया। पी chrysosporium उत्पादित विभिन्न glucans, स्टार्च और xylans (चित्रा 3E) की गिरावट के लिए एंजाइमों। लोअर संकेतों hemicelluloses arabinan (चुकंदर) और pectic galactan लिए और साथ ही आरजीआई (सोयाबीन) के लिए पता लगाया जा सकता है। एंजाइमों का उत्पादन अम्लीय शर्तों (पीएच 4.0) तटस्थ या थोड़ा बुनियादी शर्तों (पीएच 8.0) की तुलना में अधिक सक्रिय थे। आईसीबी substrates के प्रति कम गतिविधि (चित्रा 3F)यह दर्शाता है जब polysaccharides एक अधिक प्राकृतिक संदर्भ में हैं, एंजाइम की दक्षता में एक शुद्ध polysaccharide के साथ के रूप में ही नहीं है कि और यही वजह है कि आईसीबी substrates, एंजाइम दक्षता पर एक और अधिक यथार्थवादी दृष्टिकोण को प्रदर्शित करता है, तो यह कच्चे या पूर्व के लिए लागू किया गया था इलाज किया संयंत्र सामग्री। 19 CPH और 5 आईसीबी substrates। ए) प्रत्येक व्यक्ति सब्सट्रेट के लिए 4 कुओं के साथ थाली स्थापना के एक योजना युक्त एक बहु सब्सट्रेट प्लेट का उपयोग Phanerochaete chrysosporium की एक 3 दिन पुराने तरल संस्कृति से एक संस्कृति सतह पर तैरनेवाला के चित्रा 3. स्क्रीनिंग (ग्रे पृष्ठभूमि = CPH substrates, नारंगी रंग की पृष्ठभूमि = आईसीबी substrates)। बी) परख सब्सट्रेट। सी युक्त थाली का चित्र) योजना के बफर कि प्रयोग में इस्तेमाल की स्थिति दिखा (200 मिमी सोडियम एसीटेट पीएच 4.0, सोडियम फास्फेट पीएच 6.0 और सोडियम फास्फेट पीएच 8.0)। डी) 25 डिग्री सेल्सियस। ई) Absorbances पर 2 घंटे के बाद उत्पाद प्लेट की तस्वीर 517 एनएम का पता चला है और प्रत्येक व्यक्ति CPH सब्सट्रेट और एफ के लिए प्लॉट किए जाते थे ) संबंधित एंजाइमों के लिए आईसीबी सब्सट्रेट का परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। chromogenic substrates भी एक अच्छी तरह से अलग अलग रंग CPH substrates के एक मिश्रण का उपयोग और उपचार के बाद प्रतिक्रिया सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण एकल एंजाइमों का उपयोग कर या कॉकटेल एंजाइम द्वारा synergistic प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। निम्न उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है, लाल CPH-सेल्यूलोज और पीले CPH-xylan substrates के एक लगभग equ में एक साथ मिलाया गया96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट कुओं में अल अनुपात। चित्रा -4 ए कोई एंजाइम (नियंत्रण), सेल्यूलोज सेल (2 यू / एमएल), xylanase xyl (1 यू / एमएल) और एक साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के इलाज के बाद रंग प्रतिक्रिया उत्पादों से पता चलता है दोनों एंजाइमों का मिश्रण 100 मिमी सोडियम एसीटेट बफर पीएच 4.5 (3 प्रत्येक दृष्टिकोण के लिए प्रतिकृति)। विश्लेषण के लिए, प्रतिक्रिया उत्पाद 700 एनएम (चित्रा 4 बी) के लिए 350 एनएम से absorbance स्पेक्ट्रम स्कैनिंग द्वारा spectrophotometrically मात्रा निर्धारित किया गया था। अक्सर अकेले दृश्य निरीक्षण एंजाइम एक या एकाधिक substrates पर काम कर रहा है कि क्या का एक संकेत दे सकता है, लेकिन दर्ज की absorbance के स्पेक्ट्रा अलग रंगों से उत्पन्न भी सरल रेखीय प्रतिगमन 8 का उपयोग कर प्रत्येक की गिरावट की हद तक का एक और अधिक सटीक संकेत देने के लिए हल किया जा सकता मिश्रण से सब्सट्रेट। CPH substrates का उपयोग के रूप में काफी मिश्रण परख के throughput के लिए कहते हैं, एससीआर सक्षम करने के लिएएक प्रयोग (एक अच्छी तरह से) में अप करने के लिए 4 अलग substrates के खिलाफ eening। दिखाए गए उदाहरण में चार अलग-अलग इस्तेमाल किया substrates हैं: नीले CPH-β-glucan (जौ), पीला CPH-xylan (Beechwood), हरी CPH-amylose और लाल CPH-pectic galactan (वृक)। सब्सट्रेट प्लेट के लेआउट चित्रा 4C और चित्रा 4D में परख थाली का एक चित्र में दिखाया गया है। प्रतिक्रिया 25 डिग्री सेल्सियस और 150 rpm पर 30 मिनट के लिए 100 मिमी सोडियम एसीटेट बफर पीएच 4.5 में प्रदर्शन किया गया था। बढ़ती एंजाइम एकाग्रता के साथ पहला एकल एंजाइमों इसी CPH सब्सट्रेट (चित्रा 4E) और रंग की सतह पर तैरनेवाला के साथ परीक्षण किया गया उत्पाद थाली में उम्मीद के रूप में प्राप्त किया गया था (चित्रा 4F, पंक्ति 1 ए – 12D)। पंक्ति ई निहित दो अलग CPH substrates पीले CPH-xylan और नीले CPH-β-glucan, जो इसी एंजाइम की एंडो -xylanase और एंडो -glucanase अलग अनुपात के साथ अपमानित किया गया। प्रतिक्रिया के बाद, परिणाम visib हैउत्पाद थाली में Le: प्रतिक्रिया उत्पाद का रंग था गहरे रंग हरे-नीले, जब अधिक एंडो -glucanase उपस्थित थे (चित्रा 4F, 4E-6E) और, एक हल्का पीले, हरे जब एंडो -xylanase एकाग्रता में वृद्धि हुई है में बदल गया ( चित्रा 4F, 10-12E)। एक ही पंक्ति एफ, जहां दो substrates लाल CPH-pectic galactan और पीले CPH-xylan साथ एंडो -galactanase और एंडो -xylanase अपमानित किया गया में देखा जाता है। सभी चार अलग अलग रंग CPH सब्सट्रेट वर्तमान (चित्रा 4F, 1G-12F) और एकल एंजाइमों उचित CPH सब्सट्रेट अपमानित और अतिरिक्त जोड़ने एंजाइमों रंग प्रतिक्रिया उत्पादों का एक संयोजन प्राप्त किया गया था द्वारा किया गया। चित्रा 4. दो अलग CPH substrates की एक संयोजन, लाल CPH-सेल्यूलोज और पीले CPH-xylan, विभिन्न एंजाइमों के साथ इलाज किया। ए)) दोनों एंजाइमों। बी) प्रतिक्रिया supernatants के absorbance स्पेक्ट्रा एंडो -cellulase (सेल के साथ दो substrates या एंडो -xylanase (xyl) या इलाज के बाद रिएक्शन supernatants। विभिन्न एंजाइमों के साथ इलाज के चार अलग अलग CPH substrates की एक संयोजन सी) सब्सट्रेट CPH substrates युक्त थाली की योजना:। नीले CPH-β-glucan (जौ), पीला CPH-xylan (Beechwood), हरी CPH-amylose और लाल CPH- pectic galactan (वृक) डी) परख अलग CPH substrates युक्त थाली का चित्र ई) उत्पाद जोड़ा एंजाइमों के अनुपात दिखा प्लेट की योजना (नाममात्र सांद्रता (नेकां):।। ग्लू = 1 यू / एमएल एंडो -glucanase, 25 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के बाद ऊष्मायन xyl = 1 यू / एमएल एंडो -xylanase, एमी = 5 यू / एमएल एंडो -amylase और लड़की = 0,5 यू / एमएल एंडो -galactanase)। एफ) उत्पाद प्लेट का चित्र। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। सब्सट्रेट स्रोत CPH-2-hydroxyethylcellulose एन / ए (CPH-2-HE-सेल्यूलोज) CPH-amylopectin आलू CPH-amylose आलू CPH-arabinan मीठे चुक़ंदर CPH-arabinoxylan गेहूँ CPH कैसिइन गोजातीय दूध CPH-chitosan जानवर मूल CPH-curdlan Alcaligenes faecalis CPH-dextran Leuconostoc एसपीपी। </eM> CPH-galactomannan carob CPH-laminarin laminaria digitata CPH-lichenan आइसलैंडिक मॉस CPH-methylcellulose एन / ए CPH-pachyman Poria कोकोस CPH-pectic galactan आलू CPH-पुलुलान Aureobasidium pullulans CPH-rhamnogalacturonan मैं (आरजी मैं) आलू CPH-rhamnogalacturonan मैं (-Gal) * आलू CPH-rhamnogalacturonan सोया CPH-xylan Beechwood CPH-xyloglucan इमली जौ से CPH-β-glucan जौ जई से CPH-β-glucan जई </td> खमीर से CPH-β-glucan ख़मीर आईसीबी-Arabidopsis थाली Arabidopsis से पत्ते थालिअना कर्नल-0 (वयस्क संयंत्र) आईसीबी-Arabidopsis बीज अरबीडोफिसिस थालीआना आईसीबी-खोई Saccharum officinarum (सूखे वयस्क संयंत्र, स्टेम और पत्तियों) आईसीबी क्रिस्टलीय सेलूलोज (फिल्टर पेपर) वाणिज्यिक वाटमान 3 मिमी Chr क्रोमैटोग्राफी कागज आईसीबी-मेथी के बीज Trigonella एसपीपी। बीज आईसीबी-भांग भांग एसपीपी। (सूखे वयस्क संयंत्र, स्टेम और पत्तियों) आईसीबी-वृक बीज Lupinus बीज angustifolius आईसीबी-पराग पी pratense Phleum pratense पराग आईसीबी-सुथरा Picea एसपीपी। (मीलlled पेड़ के तने) आईसीबी-तंबाकू निकोटियाना benthamiana से पत्तियां (युवा संयंत्र) आईसीबी-गेहूं के भूसे ट्रिटिकम एसपीपी। (सूखे वयस्क संयंत्र, स्टेम और पत्तियों) आईसीबी-विलो सेलिक्स एसपीपी। (सूखे वयस्क संयंत्र, milled पेड़ के तने) आईसीबी-चारा चारा एसपीपी। (वयस्क संयंत्र से पत्ते) * (β-1,4-डी-galactan पक्ष के साथ हटाया चेन एंडो -β-1,4-डी-galactanase) तालिका 1. उपलब्ध chromogenic पॉलिमर हाइड्रोजेल (CPH) और अघुलनशील chromogenic बायोमास (आईसीबी) substrates की सूची।

Discussion

हम जानते हैं कि chlorotriazine रंगों के आधार पर कर रहे हैं बहुरंगी CPH और आईसीबी substrates की एक नई पीढ़ी (तालिका 1 में substrates की पूरी सूची) का उपयोग कर रहे एक कस्टम डिजाइन वाणिज्यिक परख किट में व्यवस्था की। Substrates के एंजाइम पाचन छोटे, घुलनशील, रंगे उत्पादों जो परख समाधान में पहचाने जा रहे हैं और एक प्लेट पाठक ⁹ का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है अर्जित करता है। इस परख एंडो -acting एंजाइमों का मूल्यांकन और परख की संवेदनशीलता के लिए डिज़ाइन किया गया है AZURINE पार से जुड़े (AZCL) का उपयोग कर एक substrates ¹⁰ है, जबकि अन्य तरीकों EXO -acting एंजाइमों ^11,12 के लिए उपलब्ध हैं इसी तरह की है। इस परख किट की सीमा steric बाधा डाई और crosslinker अणुओं ⁸ से उत्पन्न होने के कारण, एंडो -enzyme गतिविधि का पता लगाने में निहित के रूप में CPH के साथ ही आईसीबी substrates सड़ सकने नहीं EXO सबसे अधिक संभावना -enzymes से कर रहे हैं।

परख एक 96 wel में किया जाता हैएल प्रारूप और व्यक्तिगत प्रतिक्रियाओं कुओं में जगह ले लो। प्रतिक्रिया की थाली में मिलाया जा करने के लिए प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य डेटा प्राप्त करने के लिए है। जिसके परिणामस्वरूप supernatants एक उत्पाद प्लेट जहां प्रत्येक कुएं के absorbance absorbance स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है में छान रहे हैं। बुनियादी सिद्धांतों और परख के लेआउट चित्र 1 में दिखाया गया है। परख एक परख प्लेट (एक 96 अच्छी तरह से फिल्टर प्लेट) substrates के साथ होते हैं, और एंजाइमों के साथ ऊष्मायन के बाद, सतह पर तैरनेवाला एक स्पष्ट अच्छी तरह से थाली में के माध्यम से फ़िल्टर किया जाता है और absorbances एंजाइम विशिष्टता और गतिविधि की एक अर्द्ध मात्रात्मक माप उपलब्ध कराने पढ़ रहे हैं। यह दिखाया गया है कि इस स्क्रीनिंग CPH substrates का उपयोग परख भी एक अगर प्लेट प्रारूप, जहां घुलनशील प्रतिक्रिया उत्पादों रात ऊष्मायन के बाद एक रंग का प्रभामंडल बनाने में इस्तेमाल किया जा सकता है। ⁸

परख किट के रूप में प्रदर्शन शुद्ध एंजाइम और अपनी क्षमता पक्ष गतिविधियों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताचित्रा 2। साइड गतिविधियों एक एंजाइम है और इसके अनेक विशिष्टता से, लेकिन यह भी एक तथ्य है कि नमूना विश्लेषण किया विभिन्न एंजाइमों का एक मिश्रण है और उनके समन्वित प्रभाव का अध्ययन किए जाने की जरूरत से पैदा कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, के रूप में यह पिछले अध्ययनों में दिखाया गया है, कि कवक ⁸ के साथ ही अंतर्जात संयंत्र एंजाइम और बैक्टीरिया (अप्रकाशित डेटा) से एंजाइम कॉकटेल, पेट microbiota ¹³ और संस्कृति बतख एक एंजाइम स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।

आईसीबी substrates अक्सर बायोमास टूटने के औद्योगिक प्रक्रियाओं में सामना करना पड़ा कोशिका दीवार घटकों के जटिल मिश्रण को संबोधित। इन substrates polysaccharide उपलब्धता का मूल्यांकन और कैसे प्रभावी ढंग से और अधिक कुशल गिरावट उत्पादन के लिए गिरावट कॉकटेल का अनुकूलन करने के बारे में जानकारी प्रदान करने के लिए तैयार कर रहे हैं। जैसा कि चित्र में सचित्र 3 CPH और आईसीबी substrates पक्ष द्वारा एंजाइम स्क्रीनिंग पक्ष में इस्तेमाल किया जा सकता है – एंजाइम विशिष्टता के बारे में जानकारी का खजाना खुलासादोनों वरीय सब्सट्रेट (CPH) और एक अधिक प्राकृतिक जटिल वरीय सब्सट्रेट और अधिक बारीकी से प्रकृति (आईसीबी) में पाया गया एक macromolecular विधानसभा नकल उतार के अलावा अन्य घटकों से युक्त के संदर्भ में विकास गतिविधियों। कई रंगों के उपयोग के कई substrates जो उच्च throughput और परख के multiplexity वृद्धि के खिलाफ अलग एंजाइम गतिविधियों के एक साथ पता लगाने के लिए अनुमति देता है। अलग-अलग रंगों के स्पेक्ट्रा सरल रेखीय प्रतिगमन द्वारा और ज्यादातर मामलों बहु सब्सट्रेट गतिविधि अकेले दृश्य निरीक्षण द्वारा मनाया जा सकता है में हल किया जा सकता है। इस तरह के प्रयोग और उसके परिणामों के एक नकली उदाहरण चित्रा 4 में दिखाया गया है।

इस परख उपकरण बॉक्स और उसके आवेदन की चंचलता बहुत अच्छी तरह से एंजाइम और अज्ञात गतिविधियों के साथ संस्कृति बतख की पहली स्तरीय स्क्रीनिंग के लिए अनुकूल हैं। इस परख के सर्वाधिक महत्वपूर्ण पहलुओं में अपनी उच्च throughput प्रकृति, customizability, उपयोग और लचीलेपन की आसानी रहे हैं। मन में है कि, w के साथई का मानना ​​है कि उपकरण के इस उपन्यास सेट काफी सुधार और औद्योगिक में एंजाइम स्क्रीनिंग प्रक्रिया के साथ-साथ शैक्षणिक आवेदनों को गति देगा।

Materials

assay kit plates	Glycospot		customized assay kit plates
activation solution	Glycospot		for activating CPH substrates
350 ml receiver plate spacer block for vacuum manifold	Pall Corporation	5015	spacer block
96-well MultiScreen HV filter plate, 0.45 µm, clear, non-sterile	Millipore	MSHVN4510	assay plate
96-Well Microplates, Polypropylene	Greiner Bio-One	651201	collection plate after washing the substrates
Nunc™ MicroWell™ 96-Well Microplates	Thermo Scientific	269620	product plate
Diaphragm pump MZ 2 NT	Vacuubrand	732000	vacuum pump used with the vacuum manifold
Infors HT Ecotron	Infors HT	4950132 (Buch & Holm)	horizontal shaker
SpectraMax M5	Molecular Devices	10067-750 (VWR)	96-well plate absorbance reader
Vacuum manifold	Pall Corporation	5017	vacuum manifold
endo-cellulase (EGII) (Trichoderma longibrachiatum)	Megazyme	E-CELTR	cellulase [cel]
endo-β-1,4-mannanase (Cellvibrio japonicus)	Megazyme	E-BMACJ	mannanase [man]
endo-β-1,3-glucanase (Trichoderma spp.)	Megazyme	E-LAMSE	β-glucanase [glu]
endo-b-1,4-D-galactanase (Aspergillus niger)	Megazyme	E-EGALN	galactanase [gal]
endo-β-1,4-xylanase M4 (Aspergillus niger)	Megazyme	E-XYAN4	xylanase [xyl]
endo-xyloglucanase (GH5) (Paenibacillus sp.)	Megazyme	E-XEGP	xyloglucanase [xg]
α-amylase (Bacillus licheniformis)	Megazyme	E-BLAAM	amylase [amy]