Descriviamo qui un metodo di estrazione del DNA semplice e rapida cartaceo di HIV provirale DNA da sangue intero rilevato mediante PCR quantitativa. Questo protocollo può essere esteso per l'utilizzo nel rilevare altri marcatori genetici o utilizzando metodi di amplificazione alternativi.
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Articolo metodologico
L'isolamento di filtrazione di acidi nucleici: DNA metodo di estrazione semplice e veloce
In questo articolo
Sommario
Abstract
FINA, isolamento filtrazione di acidi nucleici, è un metodo di estrazione romanzo che utilizza filtrazione verticale tramite una membrana di separazione e tampone assorbente per estrarre DNA cellulare da sangue intero in meno di 2 min. Il campione di sangue viene trattata con un detergente, brevemente mescolato e applicato dalla pipetta alla membrana di separazione. Il lisato stoppini nel tampone assorbente per capillarità, catturando il DNA genomico sulla superficie della membrana di separazione. Il DNA estratto viene conservato sulla membrana nel corso di una semplice fase di lavaggio in cui gli inibitori della PCR sono malvagi nel tampone assorbente assorbente. La membrana contenente il DNA intrappolata viene quindi aggiunto alla reazione PCR senza ulteriore purificazione. Questo semplice metodo non richiede attrezzature di laboratorio e può essere facilmente implementato con materiale di laboratorio poco costoso. Qui si descrive un protocollo per il rilevamento ad alta sensibilità e la quantificazione del virus HIV-1 DNA provirale da 100 ml di sangue intero come modello per l'inizio inDiagnosi fant del virus HIV che potrebbe facilmente essere adattato per altri obiettivi genetici.
Introduzione
Diversi rapporti hanno discusso lo sviluppo di metodi di estrazione carta- o membrana a base per l'uso in point-of-care (POC) dispositivi di 1-5, con l'obiettivo di rendere la sensibilità squisita e la specificità della diagnostica molecolare a disposizione di tutti. L'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS) Malattie Sessualmente Trasmesse Diagnostica iniziativa ha coniato il termine ASSURED (a prezzi accessibili, sensibile, specifico, facile da usare, veloce e robusto, senza attrezzature e distribuito chi ne ha bisogno) per descrivere le caratteristiche ideali di un POC Test 6. Di queste linee guida, la caratteristica senza attre....
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Protocollo
Etica dichiarazione: I campioni di sangue intero utilizzate in questo studio non sono considerati come ricerca che coinvolge soggetti umani. I campioni sono stati ottenuti per scopi diagnostici clinici, che sono state soddisfatte, e la porzione restante di questi campioni è stato fornito per il dosaggio di ricerca FINA. I campioni sono stati codificati in modo tale che i ricercatori non sono stati in grado di accertare facilmente l'identità degli individui.
1. Preparazione della FINA campione Modulo di preparazione
- Preparare tampone assorbente tagliando un 35 x 35 mm 2 di un 2,6 mm batuffolo di cotone al 100% di spessore. Tagliare un....
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Risultati
Il flusso di lavoro per l'estrazione del DNA provirale dal sangue intero addizionato di cellule 8e5-LAV è mostrato in Figura 1. La Figura 2 mostra il modulo di esempio FINA e preparati tubo qPCR. Questo metodo consente efficiente amplificazione del HIV-1 provirus da cellule 8e5-LAV a differenti numeri di copia, come mostrato nella curva standard di esemplari artificiosa (Figura 3). PCR ha avuto un rendimento del 103%, come calcolato .......
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Discussione
EID legata al trattamento di accesso rapido ha dimostrato di ridurre la mortalità infantile a causa di infezione da HIV 16. A causa della persistenza di anticorpi materni nel sangue di un neonato, rapidi test degli anticorpi HIV hanno limitato l'utilità per determinare il carattere dei bambini HIV-esposti. L'OMS raccomanda che tutti i bambini nati da madri HIV-1 positivi dovrebbero essere testati a 4-6 settimane di età, utilizzando un test virologico 17. Abbiamo riportato lo sviluppo di un .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo sviluppo del protocollo è stato supportato dalla sovvenzione 37774 della Bill and Melinda Gates Foundation Grand Challenges in Global Health. I reagenti e i consigli per la PCR in tempo reale sono stati forniti da Abbott Molecular Inc. Des Plaines, IL. Le cellule 8E5-LAV sono state fornite dal Laboratorio di Garanzia della Qualità di Virologia, Rush Presbyterian; Centro medico di San Luca. Il sangue HIV-1 negativo è stato fornito da Core Lab, NorthShore University HealthSystems, Evanston, IL. Grazie a Mark Fisher per l'aiuto fotografico.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Fusion 5 | GE Healthcare Life Sciences | 8151-9915 | |
| 707 tampone assorbente | VWR International | 28298-014 | |
| PARAFILM M | VWR International | 52858-000 | |
| Nastro diagnostico in poliestere a doppio rivestimento 3M | 3M Medical Specialties | 9965 | |
| 200 µ l Provette per strisce qPCR | Agilent | 401428 | |
| tappi per strisce ottiche | Agilent | 401425 | |
| Sistema qPCR Mx3005p | Agilent | 401456 | |
| idrossido di sodio | Sigma-Aldrich | 221465 | A.C.S. Reagente |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | BioXtra |
| dimetil solfossido | Sigma-Aldrich | D8418 | per biologia molecolare |
| siero fetale bovino, certificato, origine statunitense | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | |
| Punzone piccolo avvitato a martello diametro foro 3/16" (5,1 mm) | McMaster Carr | 3424A16 | |
| Punzone piccolo avvitato a martello diametro foro 1/4" (7,14 mm) | McMaster Carr | 3424A19 | |
| Punzone piccolo avvitato a martello diametro foro 5/16" (8,35 mm) | McMaster Carr | 3424A23 |
Riferimenti
- Byrnes, S. A., et al. One-step purification and concentration of DNA in porous membranes for point-of-care applications. Lab Chip. 15 (12), 2647-2659 (2015).
- Connelly, J. T., Rolland, J. P., Whitesides, G. M. "Paper Machine" for Molecular Diagnostics. Anal Chem
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Ristampe e permessi
