Visualisering af HIV-1 Gag binding til Giant unilamellare vesikel (GUV) Membraner
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
Den strukturelle protein af HIV-1, Pr55 Gag (eller Gag), binder til plasmamembranen i celler under virus samleprocessen. Membran binding af Gag er et vigtigt skridt for dannelse virus partikel, da en defekt i Gag membran bindende resultater i alvorlig svækkelse af viral produktion partikel. For at få mekanistiske detaljer om Gag-lipidmembran interaktioner, in vitro-metoder baseret på NMR, protein footprinting, overfladeplasmonresonans, liposom flotation centrifugering eller fluorescens lipid kuglebinding blevet udviklet hidtil. Men hver af disse in vitro-metoder har sine begrænsninger. For at overvinde nogle af disse begrænsninger og tilvejebringe en komplementær tilgang til de tidligere etablerede metoder, udviklede vi et in vitro assay, hvor interaktioner mellem HIV-1 Gag og lipidmembraner finder sted i en "celle-lignende" miljø. I dette assay Gag binding til lipidmembraner visuelt analyseret under anvendelse YFP-tagged Gag syntetiseret i en hvedekim-baserede in vitro translation system, og GUVs udarbejdet af en electroformation teknik. Her beskriver vi baggrunden og de protokoller, for at opnå Myristoylated fuld længde Gag proteiner og GUV membraner, der er nødvendige for analysen og opdage Gag-GUV binding ved mikroskopi.
Introduction
Humant immundefektvirus type 1 (HIV-1) er et kappebærende virus, der samler på og knopper fra plasmamembranen (PM) i de fleste celletyper. Samlingen af HIV-1 viruspartikler er drevet af 55 kDa viralt kerneprotein kaldet Pr55 Gag (Gag). Gag syntetiseres som en precursor polyprotein består af fire store strukturelle domæner, nemlig matrix, capsid, nucleocapsid og p6, samt to spacer peptider SP1 og SP2. Under montering, matricen (MA) domæne er ansvarlig for målretning af Gag til forsamlingen site, capsid (CA) domæne medierer Gag-Gag interaktioner, nucleocapsid (NC) domæne rekrutterer viralt genomisk RNA, og p6 rekrutter vært faktorer at støtten viruspartikel spaltning fra plasmamembranen. Gag undergår også en co-translationel modifikation ved tilsætning af en 14-carbon fedtsyre eller myristat-delen ved dens N-terminus.
Membran binding af Gag er en væsentlig forudsætning for den virale samling, da mutants der er defekt i membranen binding ikke producere viruspartikler. Vi og andre har vist, at membranen binding af Gag medieres af tosidede signaler i MA domæne: det N-terminale myristat-del, der medierer hydrofobe interaktioner med lipiddobbeltlaget og en klynge af basiske rester i MA domæne betegnes som stærkt basiske region ( HBR), der interagerer med sure lipider på PM 1-4. Studier af Gag-membran interaktioner under anvendelse ektopisk ekspression af polyphosphoinositide 5-phosphatase IV (5ptaseIV), et enzym, der katalyserer hydrolysen af PM-specifik surt phospholipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] til phosphatidylinositol-4-phosphat, i celler antydede, at Gag-PM lokalisering medieres af PI (4,5) P2 3,5. Men in vitro-undersøgelser med sigte på at forstå mere mekanistiske detaljer Gag-PI (4,5) P 2 interaktioner har vist sig at være en udfordring for en række årsager. TilEksempelvis har oprensning af fuld længde myristoylerede HIV-1 Gag til biokemiske eksperimenter været teknisk vanskeligt i det mindste delvis på grund af tendensen til, Gag at aggregere under oprensning. Derfor trunkerede former af HIV-1 gag, såsom Myr-MA eller Myr-MA-CA, eller den ikke-myristoylerede formular, er blevet hyppigt anvendt til undersøgelser, der kræver Gag oprensning (f.eks kernemagnetisk resonans, protein footprinting, og overfladen plasmonresonans 6-9). Alternativt koblet in vitro-transkription-translationsreaktioner er blevet anvendt til at producere fuld-længde myristoylerede HIV-1 Gag i andre biokemiske undersøgelser 1,2. Typisk i dette system, er en Gag-kodning plasmid transskriberet og oversat med eukaryote cellelysater (f.eks kanin reticulocytlysater), som er blottet for enhver cellemembraner og messenger RNA'er men indeholder maskiner til transskription og translation. Efter reaktionen er cellelysater indeholdende Gag blandet med migmbranes til analyse af GAG-interaktioner med lipider. Foruden den lette fremstilling fuld længde myristoylerede Gag, fremgangsmåder, der anvender in vitro-transskription translationssystem har en fordel, at Gag-syntese og efterfølgende membran bindingsreaktioner forekommer i en "eukaryot cytosol-lignende" miljø, der kan bedre repræsentere fysiologiske betingelser. Denne egenskab har bidraget til de undersøgelser, der viste, at RNA-molekyler bundet til MA domænet regulere Gag binding til sure lipider i et konkurrencepræget måde 1,2,10-12. Da den samlede mængde af Gag-proteiner opnået ved disse cellelysater er ikke høje, metabolisk mærkning af proteiner med radiomærkede aminosyrer er nødvendig for deres detektion.
Afhængig af fremgangsmåden til måling af Gag-lipid interaktioner, har en bred vifte af membranpræparater blevet anvendt. Hver af disse metoder har sine styrker og begrænsninger. De fleste NMR-baserede assays kræver anvendelsen af lipider med korte acylkæder, der er vandopløselige (f.eks C4- og C8-PI (4,5) P2) 6,8. Mens NMR metoder til at teste binding af Gag til de lipider, der har lange acylkæder findes i cellerne der udvikles, er de blevet brugt kun med myristoyleret eller nonmyristoylated MA hidtil 8,13. Alternativt er liposomer fremstillet ud fra lipider, som har native længde acylkæder blevet anvendt i biokemiske fremgangsmåder, såsom liposom flotation eller fluorescerende liposom bead bindingsassays 2,3,10,14-16. Men liposomer anvendt i disse assays har små diametre, og dermed deres membraner har stejle og positive krumninger. I modsætning hertil i den tidlige fase af partikelsamling i HIV-1-inficerede celler, Gag binder til PM, som er næsten plane om omfanget af Gag, og efterfølgende inducerer negativ krumning under knopskydning. Derfor kan liposommembraner med stejle og positiv krumning ikke være ideel lipiddobbeltlag for at studere Gag-lipid interaktioner. Som for liposom Flotation analyser, en anden potentiel advarsel er, at eksponeringen af Gag-lipidkomplekser til hypertonisk saccharosegradient under centrifugering kan påvirke den eksperimentelle resultat. At afhjælpe disse begrænsninger og tilvejebringe en komplementær eksperimentelle system, har assays for Gag-binding til giant unilamellare vesikler (GUVs) blevet udviklet i de senere år. GUVs er enkelte lipiddobbeltlagsvesikler hvis diametre udvides til flere snese mikrometer. Således krumning disse membraner ligner PM på omfanget af Gag. På grund af sin størrelse, som muliggør visuel inspektion under optiske mikroskoper, membran binding af fluorescerende mærkede eller mærkede Gag-proteiner til disse vesikler efter blanding kan let bestemmes uden efterfølgende bearbejdning af Gag-lipidkomplekser.
Vi her beskriver en protokol for at studere HIV-1 Gag membran binding ved hjælp GUVs opnået fra en electroformation metode. Forskellige metoder såsom blid hydrering, gel-assisteret hydrering, microfluidic jetting, og electroformation 17-22 er blevet anvendt til at opnå GUVs. For protokollen beskrevet her, er den electroformation anvendte primært på grund af dens effektivitet ved dannelse GUVs med sure lipider og dens relative anvendelse uden behov for dyre opsætninger. Da visualisering af Gag nødvendiggør en fluorescerende reporter, er gult fluorescerende protein (YFP) genetisk tilsat til C-terminalen af Gag (Gag-YFP). Gag-YFP proteiner opnås ved in vitro-transskription og oversættelse reaktioner i hvedekim lysater baseret på den løbende udveksling-kontinuerlig strøm (CECF) teknologi. I denne teknologi er både fjernelse af inhiberende biprodukter af de reaktioner og levering af reaktionssubstrater og energikomponenter opnået i et dialyse-mekanisme. For disse reaktioner, er et plasmid, der koder Gag-YFP under kontrol af en T7-promotor anvendes. Notatet som vist tidligere, hvedekim lysater understøtter myristoylering uden yderligere komponenter 23,24. Ved hjælp af denne metode, har det været muligt at opnå tilstrækkelige mængder af fuld længde myristoylerede Gag-YFP til visualisering af Gag på GUV membraner 24. Her beskriver vi den protokol, hvormed HIV-1 Gag-binding til PI (4,5) P2-holdige GUV membraner kan undersøges uden langvarig efterfølgende bearbejdning efter bindingsreaktioner og foreslår, at denne metode supplerer allerede eksisterende Gag-membran bindingsassays og kan være udvides til yderligere at forstå HIV-1 Gag-membran-binding.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den GUV bindingsassay som beskrevet ovenfor giver et godt alternativ i scenarier, hvor andre protein-lipid interaktion assays har deres begrænsninger. Dette assay giver os mulighed for at undersøge interaktioner mellem myristoyleret fuldlængde Gag og sure lipider med nativ længde acylkæder i lipiddobbeltlaget kontekst og gøre det uden langvarig flotation centrifugering gennem high-density saccharosegradienter eller andre post-bindende forarbejdning af Gag-lipid komplekser. En anden fordel er, at opførslen af Gag …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke Mohammad Saleem, Jing Wu og Krishnan Raghunathan for nyttige diskussioner. Vi takker også Priya Begani for hjælp under optagelserne. Dette arbejde er støttet af National Institutes of Health giver R01 AI071727 (til AO) og R01 GM110052 (til SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Riferimenti
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochimica. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochimica. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochimica. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
