Visualisatie van HIV-1 Gag Binding aan Giant Unilamellaire bolletjes (GUV) Membranen
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
De structurele eiwitten van HIV-1, Pr55 Gag (of Gag), bindt aan het plasmamembraan van cellen tijdens de virus assemblageproces. Membraanbinding van Gag is een essentiële stap voor de vorming virusdeeltje, omdat een defect in Gag membraan binding resulteert in een ernstige vermindering van virale deeltjes productie. Mechanistisch data van Gag-lipide membraaninteracties krijgen, in vitro methoden op basis van NMR, eiwit voetafdruk, oppervlakte plasmon resonantie, liposoom flotatie centrifugatie of fluorescentie lipide bead binding tot dusver ontwikkeld. Echter, elk van deze in vitro werkwijzen zijn beperkingen. Sommige van deze beperkingen te overwinnen en zorgen als aanvulling op de eerder vastgestelde methoden, ontwikkelden we een in vitro assay waarbij interacties tussen HIV-1 Gag en lipidemembranen plaatsvinden in een "cel-achtige" omgeving. In deze test, Gag binding aan lipide membranen visueel geanalyseerd met YFP-Tagged Gag gesynthetiseerd in een tarwekiemen-gebaseerde in vitro translatie-systeem en GUVs voorbereid door een electroformation techniek. Hier beschrijven we de achtergrond en de protocollen gemyristoyleerde full-length Gag eiwitten en GUV membranen die nodig zijn voor de test te verkrijgen en om binding door microscopie detecteren Gag-GUV.
Introduction
Humaan immunodeficiëntievirus type 1 (HIV-1) is een omhuld virus dat assembleert op en knoppen van de plasmamembraan (PM) in de meeste celtypen. Het samenstel van HIV-1 virusdeeltjes wordt aangedreven door de 55 kDa viruskern eiwit Pr55 Gag (Gag). Gag wordt gesynthetiseerd als een precursor polyeiwit uit vier belangrijke structurele domeinen, namelijk matrix, capside, nucleocapside, en p6, evenals twee afstandhouder peptiden SP1 en SP2. Bij de montage, de matrix (MA) domein is verantwoordelijk voor het richten van Gag aan de plaats, het capside (CA) domein bemiddelt Gag-Gag interacties, het nucleocapside (NC) domein werft viraal genoom RNA en p6 rekruten gastheer factoren die steun virusdeeltje splitsing van het plasmamembraan. Gag ondergaat een co-translationele modificatie door de toevoeging van een 14-koolstof vetzuur of myristaat deel aan zijn N-terminus.
Membraanbinding van Gag is een essentiële voorwaarde voor de virale assemblage, aangezien mutants dat defect is in membraan binding zijn niet aan virusdeeltjes te produceren. Wij en anderen hebben aangetoond dat membraanbinding van Gag wordt gemedieerd door tweedelige signalen in de MA domein: het N-terminale myristaat groep die hydrofobe wisselwerkingen medieert de lipide bilaag en een cluster van basische resten in de MA domein aangeduid als zeer basisgebied ( HBR) die interageert met zure lipiden op de PM 1-4. Studies van Gag-membraaninteracties behulp ectopische expressie van polyphosphoinositide 5-fosfatase IV (5ptaseIV), een enzym dat de hydrolyse van PM-specifieke zure fosfolipiden phosphatidylinositol- katalyseert (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] aan fosfatidylinositol-4-fosfaat, in cellen suggereerde dat Gag-PM lokalisatie wordt gemedieerd door PI (4,5) P2 3,5. In vitro studies uitvoeren om meer inzicht mechanistische informatie van Gag-PI (4,5) P2 interacties bewezen uitdagend om een aantal redenen. VoorZo is zuivering van volledige lengte gemyristoyleerde HIV-1 Gag biochemische experimenten technisch moeilijk ten minste gedeeltelijk als gevolg van de neiging van Gag te aggregeren tijdens de zuivering. Derhalve afgeknotte vormen van HIV-1 Gag, zoals Myr-MA of Myr-MA-CA, of niet-gemyristoyleerde vorm zijn veelvuldig bij studies die Gag zuivering vereisen (bijvoorbeeld kernmagnetische resonantie, eiwitten footprinting en oppervlak plasmon resonance 6-9). Als alternatief gekoppelde in vitro transcriptie-translatie reacties zijn gebruikt om full-length gemyristoyleerde HIV-1 Gag in andere biochemische studies 1,2 produceren. Typisch in dit systeem wordt een Gag-coderende plasmide getranscribeerd en getranslateerd met eukaryote cellysaten (bijvoorbeeld konijn reticulocyten-lysaten) die zonder enige celmembranen en messenger RNAs zijn maar bevatten de machines voor transcriptie en translatie. Na de reactie worden cellysaten bevattende Gag gemengd met membranes voor de analyse van de Prop van de interacties met lipiden. Naast het gemak van het bereiden van volledige lengte gemyristoyleerde Gag, methoden waarbij de in vitro transcriptie translatiesysteem een voordeel dat Gag synthese en daaropvolgende membraan bindingsreacties plaatsvinden in een 'eukaryote cytosol-achtige "milieu die beter kunnen vormen fysiologische omstandigheden. Deze eigenschap heeft bijgedragen aan de studies waaruit bleek dat RNA-moleculen gebonden aan de MA-domein te reguleren Gag binding aan zure lipiden in een competitieve manier 1,2,10-12. Aangezien de totale hoeveelheid eiwitten verkregen Gag deze cellysaten zijn niet hoog, metabolisch merken van eiwitten met radioactief gemerkte aminozuren nodig voor de signalering.
Afhankelijk van de methode Gag-lipide interacties te meten, hebben diverse membraan preparaten gebruikt. Elk van deze methoden heeft zijn sterke en zwakke punten. De meeste NMR-gebaseerde testen vereisen het gebruik van lipiden met korte acylgroepketens die in water oplosbare (bijvoorbeeld C4 en C8-PI (4,5) P2) 6,8 zijn. Terwijl NMR methoden voor binding van Gag testen om de lipiden die lange acylketens in cellen ontwikkeld hebben, zijn zij gebruikt alleen of gemyristoyleerde nonmyristoylated MA dusver 8,13. Als alternatief hebben liposomen bereid van lipiden die inheemse lengte acylketens zijn gebruikt in biochemische methoden, zoals liposoom beursgang of fluorescerende liposoom bead bindingstesten 2,3,10,14-16. Echter, liposomen gebruikt in deze testen hebben kleine diameters, en zo hun membranen steile positieve krommingen. Daarentegen, tijdens de vroege fase van deeltjes samenstel in HIV-1-geïnfecteerde cellen, Gag bindt aan de PM, die nagenoeg planair is op de schaal van Gag en vervolgens induceert negatieve kromming tijdens dop. Daarom zou liposoom membranen met steile en positieve kromming niet ideaal lipidendubbellagen aan Gag-lipide interacties te bestuderen. Zoals voor liposoom flotatie testen andere potentiële nadeel is dat blootstelling van Gag-lipidecomplexen hypertone sucrosegradiënt centrifugatie kan tijdens de experimentele resultaat beïnvloeden. Om deze beperkingen te verlichten en een aanvullend experimenteel systeem, zijn assays voor Gag binding aan grote unilamellaire vesicles (GUVs) zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren. GUVs zijn enkele lipide dubbellaag vesicles waarvan de diameters vergroten tot enkele tientallen micrometers. Dus de kromming van deze membranen lijkt de PM op de schaal van Gag. Bovendien, vanwege de grote omvang, die visuele inspectie mogelijk maakt onder Optische microscopen, membraan binding van fluorescent gelabeld of gemerkt Gag proteïnen deze blaasjes na mengen kan gemakkelijk worden bepaald zonder verdere behandeling van Gag-lipidecomplexen.
We beschrijven hier een protocol bij HIV-1 Gag membraan binding met behulp van GUVs verkregen uit een electroformation methode te bestuderen. Verschillende methoden zoals zachte hydratatie-gel bijgestaan hydratatie, microfluidic jetting en electroformation 17-22 zijn gebruikt om GUVs verkrijgen. Voor de hier beschreven protocol, wordt de electroformation methode vooral vanwege zijn efficiëntie bij het vormen GUVs met zure lipiden en het relatieve gemak van gebruik zonder de noodzaak van dure opstellingen. Aangezien visualisatie van Gag vereist een fluorescerende reporter wordt geel fluorescerend eiwit (YFP) genetisch toegevoegd aan de C-terminus van Gag (Gag-YFP). Gag-YFP eiwitten verkregen door in vitro transcriptie en translatie reacties tarwekiemen lysaten basis van de voortdurende uitwisseling continue stroom (CECF) technologie. In deze techniek, zowel verwijderen van remmende bijproducten van de reacties en de levering van de reactie substraten en energiecomponenten worden bereikt in een dialyse-gebaseerde mechanisme. Voor deze reacties, wordt een plasmide coderend Gag-YFP onder de controle van een T7 promoter gebruikt. Van de nota, zoals eerder aangegeven, tarwekiemen lysaten ondersteunen myristoylatie zonder extra componenten 23,24. Deze methode is het mogelijk om voldoende hoeveelheden full-length gemyristoyleerde Gag-YFP voor visualisatie van Gag op GUV membranen 24 te verkrijgen. Hier beschrijven we het protocol waarmee HIV-1 Gag binding aan PI (4,5) P2 bevattende GUV membranen kan worden onderzocht zonder langdurige verdere verwerking volgende bindende reacties en voor te stellen dat deze methode een aanvulling op reeds bestaande Gag-membraan binding assays en kan uitgebreid tot verder te begrijpen HIV-1-Gag-membraan bindend.
Protocol
Representative Results
Discussion
De GUV bindingstest zoals hierboven beschreven is, een goed alternatief scenario waar andere eiwit-lipide interacties assays hebben hun beperkingen. Deze test laat ons toe om interacties tussen gemyristoyleerde full-length Gag en zure lipiden met native-length acylketens in de lipide bilaag context te onderzoeken en doen dat zonder langdurige beursgang centrifugeren door middel van high-density sucrose gradiënten of andere post-bindende verwerking van Gag-lipide complexen. Een ander voordeel is dat het gedrag van Gag i…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We willen graag Mohammad Saleem, Jing Wu en Krishnan Raghunathan bedanken voor nuttige discussies. We danken ook Priya Begani voor assistentie tijdens het filmen. Dit werk wordt ondersteund door de National Institutes of Health subsidies R01 AI071727 (AO) en R01 GM110052 (tot SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Riferimenti
- Chukkapalli, V., Inlora, J., Todd, G. C., Ono, A. Evidence in support of RNA-mediated inhibition of phosphatidylserine-dependent HIV-1 Gag membrane binding in cells. J Virol. 87 (12), 7155-7159 (2013).
- Chukkapalli, V., Oh, S. J., Ono, A. Opposing mechanisms involving RNA and lipids regulate HIV-1 Gag membrane binding through the highly basic region of the matrix domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (4), 1600-1605 (2010).
- Chukkapalli, V., Hogue, I. B., Boyko, V., Hu, W. S., Ono, A. Interaction between the human immunodeficiency virus type 1 Gag matrix domain and phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate is essential for efficient gag membrane binding. J Virol. 82 (5), 2405-2417 (2008).
- Zhou, W., Parent, L. J., Wills, J. W., Resh, M. D. Identification of a membrane-binding domain within the amino-terminal region of human immunodeficiency virus type 1 Gag protein which interacts with acidic phospholipids. J Virol. 68 (4), 2556-2569 (1994).
- Ono, A., Ablan, S. D., Lockett, S. J., Nagashima, K., Freed, E. O. Phosphatidylinositol (4,5) bisphosphate regulates HIV-1 Gag targeting to the plasma membrane. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (41), 14889-14894 (2004).
- Saad, J. S., et al. Structural basis for targeting HIV-1 Gag proteins to the plasma membrane for virus assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11364-11369 (2006).
- Shkriabai, N., et al. Interactions of HIV-1 Gag with assembly cofactors. Biochimica. 45 (13), 4077-4083 (2006).
- Vlach, J., Saad, J. S. Trio engagement via plasma membrane phospholipids and the myristoyl moiety governs HIV-1 matrix binding to bilayers. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (9), 3525-3530 (2013).
- Anraku, K., et al. Highly sensitive analysis of the interaction between HIV-1 Gag and phosphoinositide derivatives based on surface plasmon resonance. Biochimica. 49 (25), 5109-5116 (2010).
- Llewellyn, G. N., Grover, J. R., Olety, B., Ono, A. HIV-1 Gag associates with specific uropod-directed microdomains in a manner dependent on its MA highly basic region. J Virol. 87 (11), 6441-6454 (2013).
- Inlora, J., Chukkapalli, V., Derse, D., Ono, A. Gag localization and virus-like particle release mediated by the matrix domain of human T-lymphotropic virus type 1 Gag are less dependent on phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate than those mediated by the matrix domain of HIV-1 Gag. J Virol. 85 (8), 3802-3810 (2011).
- Inlora, J., Collins, D. R., Trubin, M. E., Chung, J. Y., Ono, A. Membrane binding and subcellular localization of retroviral Gag proteins are differentially regulated by MA interactions with phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate and RNA. MBio. 5 (6), e02202 (2014).
- Valentine, K. G., et al. Reverse micelle encapsulation of membrane-anchored proteins for solution NMR studies. Structure. 18 (1), 9-16 (2010).
- Dick, R. A., Goh, S. L., Feigenson, G. W., Vogt, V. M. HIV-1 Gag protein can sense the cholesterol and acyl chain environment in model membranes. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (46), 18761-18766 (2012).
- Dick, R. A., Kamynina, E., Vogt, V. M. Effect of multimerization on membrane association of Rous sarcoma virus and HIV-1 MA proteins. J Virol. 87 (24), 13598-13608 (2013).
- Alfadhli, A., Still, A., Barklis, E. Analysis of human immunodeficiency virus type 1 matrix binding to membranes and nucleic acids. J Virol. 83 (23), 12196-12203 (2009).
- Rodriguez, N., Pincet, F., Cribier, S. Giant vesicles formed by gentle hydration and electroformation: a comparison by fluorescence microscopy. Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 125-130 (2005).
- Needham, D., McIntosh, T. J., Evans, E. Thermomechanical and transition properties of dimyristoylphosphatidylcholine/cholesterol bilayers. Biochimica. 27 (13), 4668-4673 (1988).
- Darszon, A., et al. Reassembly of protein-lipid complexes into large bilayer vesicles: perspectives for membrane reconstitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (1), 239-243 (1980).
- Angelova, M. I., Dimitrov, D. S. Liposome electroformation. Faraday Discuss. Chem. Soc. (81), 303-311 (1986).
- Angelova, M. I., Soléau, S., Méléard, P. h., Faucon, F., Bothorel, P. Preparation of giant vesicles by external AC electric fields. Progr Colloid Polymer Sci. 89, 127-131 (1992).
- Stachowiak, J. C., et al. Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (12), 4697-4702 (2008).
- Yamauchi, S., et al. The consensus motif for N-myristoylation of plant proteins in a wheat germ cell-free translation system. FEBS J. 277 (17), 3596-3607 (2010).
- Olety, B., Veatch, S. L., Ono, A. Phosphatidylinositol-(4,5)-Bisphosphate Acyl Chains Differentiate Membrane Binding of HIV-1 Gag from That of the Phospholipase Cdelta1 Pleckstrin Homology Domain. J Virol. 89 (15), 7861-7873 (2015).
- Morales-Penningston, N. F., et al. GUV preparation and imaging: minimizing artifacts. Biochim Biophys Acta. 1798 (7), 1324-1332 (2010).
- Veatch, S. L. Electro-formation and fluorescence microscopy of giant vesicles with coexisting liquid phases. Methods Mol Biol. 398, 59-72 (2007).
- Ayuyan, A. G., Cohen, F. S. Lipid peroxides promote large rafts: effects of excitation of probes in fluorescence microscopy and electrochemical reactions during vesicle formation. Biophys J. 91 (6), 2172-2183 (2006).
- Montes, L. R., et al. Electroformation of giant unilamellar vesicles from native membranes and organic lipid mixtures for the study of lipid domains under physiological ionic-strength conditions. Methods Mol Biol. 606, 105-114 (2010).
- Olety, B., Ono, A. Roles played by acidic lipids in HIV-1 Gag membrane binding. Virus Res. 193, 108-115 (2014).
- Keller, H., Krausslich, H. G., Schwille, P. Multimerizable HIV Gag derivative binds to the liquid-disordered phase in model membranes. Cell Microbiol. 15 (2), 237-247 (2013).
- Carlson, L. A., Hurley, J. H. In vitro reconstitution of the ordered assembly of the endosomal sorting complex required for transport at membrane-bound HIV-1 Gag clusters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (42), 16928-16933 (2012).
- Gui, D., et al. A novel minimal in vitro system for analyzing HIV-1 Gag-mediated budding. J Biol Phys. 41 (2), 135-149 (2015).
- Prevost, C., et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nat Commun. 6, 8529 (2015).
