Visualisation du VIH-1 Gag Reliure Giant unilamellaires vésiculaires (GUV) Membranes
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
La protéine structurale du VIH-1, Pr55 Gag (ou Gag) se lie à la membrane plasmatique dans les cellules au cours du processus d'assemblage du virus. liaison de Gag membrane est une étape essentielle pour la formation de particules de virus, car un défaut dans les résultats de liaison de la membrane Gag en déficience grave de la production de particules virales. Pour avoir des détails mécanistiques des interactions avec la membrane lipidique Gag, des procédés in vitro basés sur la RMN, la protéine empreinte, la résonance plasmon de surface, des liposomes flottation centrifugation ou de la fluorescence des lipides bourrelet liaison ont été développés jusqu'à présent. Cependant, chacune de ces méthodes in vitro a ses limites. Pour surmonter certaines de ces limitations et de fournir une approche complémentaire aux méthodes précédemment établies, nous avons développé un test in vitro dans lequel les interactions entre le VIH-1 Gag et membranes lipidiques ont lieu dans un environnement "cellule-like". Dans cet essai, la liaison Gag à des membranes lipidiques est analysé visuellement à l'aide YFP Taggebase de germe d Gag synthétisé dans un blé dans le système de traduction in vitro et GUVs préparés par une technique de électroformation. Nous décrivons ici le contexte et les protocoles d'obtenir Myristoylated pleine longueur protéines Gag et les membranes GUV nécessaires pour le dosage et pour détecter la liaison par microscopie Gag-GUV.
Introduction
l'immunodéficience humaine et le virus de type 1 (VIH-1) est un virus enveloppé qui se réunit à partir des bourgeons et la membrane plasmique (PM) dans la plupart des types de cellules. L'assemblage du VIH-1 des particules virales est entraîné par la protéine virale du noyau 55 kDa , appelée Pr55 Gag (GAG). Gag est synthétisée sous la forme d'une polyprotéine précurseur composée de quatre domaines structuraux principaux, à savoir, la matrice, capside et nucléocapside, p6, ainsi que deux peptides espaceurs SP1 et SP2. Lors de l'assemblage, la matrice (MA) domaine est responsable pour le ciblage de Gag sur le site d'assemblage, la capside (CA) domaine médiatise interactions-Gag Gag, la nucléocapside (NC) domaine recrute ARN génomique viral, et les facteurs p6 recrues d'accueil que l'aide scission de la particule virale à partir de la membrane plasmatique. Gag subit également une modification de la co-traductionnelle par l'addition d'un acide gras à 14 carbones ou un fragment myristate à son extrémité N-terminale.
liaison de Gag membrane est une condition essentielle pour l'assemblage viral, puisque mutants qui sont défectueux dans la liaison membrane ne parviennent pas à produire des particules de virus. Nous et d'autres ont montré que la liaison de Gag est médiée par des signaux bipartites au sein du domaine MA membrane: le fragment myristate N-terminale qui médie les interactions hydrophobes avec la bicouche lipidique et un groupe de résidus basiques au sein du domaine MA qualifié de région hautement basique ( HBR) qui interagit avec les lipides acides de la PM 1-4. Des études d'interactions Gag-membrane en utilisant l' expression ectopique de polyphosphoinositide 5 phosphatase IV (5ptaseIV), une enzyme qui catalyse l'hydrolyse du phospholipide acide phosphatidylinositol- PM-spécifique (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P2] à phosphatidylinositol-4-phosphate, dans les cellules suggère que Gag-PM localisation est médiée par PI (4,5) P2 3,5. Cependant, des études in vitro visant à comprendre les détails plus mécanistes de Gag-PI (4,5) P 2 interactions se sont révélés être difficile pour un certain nombre de raisons. Pourpar exemple, la purification de pleine longueur myristoylés Gag VIH-1 pour des expériences biochimiques a été techniquement difficile au moins en partie en raison de la tendance de Gag à agréger lors de la purification. Par conséquent, des formes tronquées de HIV-1 Gag, comme Myr-MA ou Myr-MA-CA, ou la forme non-myristoylés ont été fréquemment utilisés dans les études qui nécessitent une purification Gag (par exemple, la résonance magnétique nucléaire, la protéine empreinte, et la surface résonance plasmonique 6-9). Alternativement, couplée à des réactions de transcription-traduction in vitro ont été utilisés pour produire toute la longueur myristoylés Gag VIH-1 dans d' autres études biochimiques 1,2. Typiquement , dans ce système, un plasmide codant pour Gag est transcrit et traduit avec des lysats de cellules eucaryotes (par exemple, les lysats de réticulocytes de lapin) qui sont dépourvues de membranes cellulaires et les ARN messagers , mais qui contiennent la machinerie de la transcription et de la traduction. Après la réaction, les lysats cellulaires contenant Gag sont mélangés avec moimbranes pour l'analyse des interactions Gag avec des lipides. En plus de la facilité de préparation de pleine longueur myristoylés Gag, les méthodes utilisant le système de traduction de transcription in vitro ont un avantage que la synthèse Gag et des réactions de liaison de la membrane subséquente se produisent dans un milieu "cytosol ressemblant eucaryote» qui peuvent mieux représenter les conditions physiologiques. Cette propriété a contribué aux études qui ont montré que les molécules d'ARN liés au domaine de MA régulent la liaison Gag aux lipides acides d'une manière compétitive 1,2,10-12. Toutefois, étant donné que la quantité totale de protéines Gag obtenues dans ces lysats cellulaires ne sont pas élevés, marquage métabolique des protéines avec des acides aminés radiomarqués est nécessaire pour leur détection.
En fonction de la méthode pour mesurer les interactions Gag-lipide, une variété de préparations de membranes ont été utilisés. Chacune de ces méthodes a ses forces et ses limites. La plupart des dosages à base de RMN nécessitent l'utilisation de lipides avec un groupe acyle courtles chaînes qui sont (C8-PI (4,5) P 2 par exemple, C4- et) 6,8 soluble dans l'eau. Bien que les méthodes de RMN pour tester la liaison de Gag aux lipides qui ont des chaînes acyles longues trouvés dans les cellules sont en cours d' élaboration, ils ont été utilisés uniquement avec myristoylée ou nonmyristoylated MA jusqu'à 8,13. En variante, les liposomes préparés à partir de lipides qui ont des chaînes acyles longueur natives ont été utilisées dans des procédés biochimiques telles que la flottation des liposomes ou des liposomes fluorescents perles de dosages de liaison 2,3,10,14-16. Cependant, les liposomes utilisés dans ces essais ont de petits diamètres et, par conséquent leurs membranes présentent des courbures fortes et positives. En revanche, au cours de la première phase de l'assemblage des particules dans les cellules du VIH-1-infected, Gag se lie à la PM, qui est presque plane sur l'échelle de Gag, et par la suite induit une courbure négative au cours de bourgeonnement. Par conséquent, les membranes de liposomes avec forte courbure positive et pourraient ne pas être bicouches lipidiques idéales pour étudier les interactions Gag-lipidique. Pour ce qui est des liposomes Flotessais de ation, une autre mise en garde potentiel est que l'exposition des complexes Gag lipidiques à gradient de saccharose hypertonique pendant la centrifugation peut influer sur le résultat expérimental. Pour pallier ces limitations et de fournir un système expérimental complémentaire, des dosages pour la liaison à Gag vésicules géantes unilamellaires (GUVS) ont été développées ces dernières années. GUVs sont des vésicules bicouches lipidiques simples dont les diamètres s'étendre à plusieurs dizaines de micromètres. Ainsi, la courbure de ces membranes ressemble à la PM à l'échelle de Gag. En outre, en raison de sa grande taille, ce qui permet une inspection visuelle au microscope optique, la liaison membrane protéines Gag de fluorescence marqués ou étiquetés à ces vésicules lors du mélange peut être facilement déterminée sans traitement ultérieur des complexes Gag-lipidiques.
Nous décrivons ici un protocole pour étudier le VIH-1 Gag membrane de liaison utilisant GUVs obtenus à partir d'une méthode de électroformation. Diverses méthodes telles que l'hydratation douce, hydratation assistée gel, microlançage rofluidic et électroformation 17-22 ont été utilisées pour obtenir GUVs. Pour le protocole décrit ici, le procédé de électroformation est utilisé principalement en raison de son efficacité dans la formation GUVs avec des lipides acides et sa relative facilité d'utilisation sans la nécessité d'installations coûteuses. Etant donné que la visualisation de Gag nécessite un rapporteur fluorescent, la protéine fluorescente jaune (YFP) est génétiquement ajouté à l'extrémité C-terminale de gag (Gag-YFP). Protéines Gag-YFP sont obtenus par des réactions in vitro de transcription et de traduction dans de blé lysats germinales en fonction du débit (CECF) la technologie d'échange continu continu. Dans cette technologie, à la fois l'élimination des sous-produits inhibiteurs des réactions et la fourniture de substrats de réaction et les composants d'énergie sont réalisées dans un mécanisme basé sur une dialyse. Pour ces réactions, un plasmide codant pour Gag-YFP sous le contrôle d'un promoteur T7 est utilisé. Il faut noter, comme indiqué précédemment, les lysats de germe de blé supportent myristoylation sans composants supplémentaires 23,24. En utilisant cette méthode, il a été possible d'obtenir des quantités suffisantes de pleine longueur myristoylés Gag-YFP pour la visualisation de Gag sur les membranes GUV 24. Nous décrivons ici le protocole avec lequel la liaison du VIH-1 Gag à PI (4,5) P2 contenant les membranes GUV peuvent être examinées sans traitement ultérieur long suivant des réactions de liaison et de proposer que cette méthode complète préexistante Gag-membrane des essais de liaison et peut être étendu pour mieux comprendre le VIH-1 Gag-membrane de liaison.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'essai de liaison de GUV tel que décrit ci-dessus donne une bonne alternative dans des scénarios où d'autres dosages d'interactions protéine-lipide ont leurs limites. Ce test nous permet d'examiner les interactions entre les myristoylée Gag pleine longueur et des lipides acides avec des chaînes acyles native de longueur dans le contexte de la bicouche lipidique et faire sans de longues flottation centrifugation à travers à haute densité des gradients de saccharose ou d'autres traitements po…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Mohammad Saleem, Jing Wu et Krishnan Raghunathan pour des discussions utiles. Nous remercions également Priya BEGANI d'assistance pendant le tournage. Ce travail est soutenu par les Instituts nationaux de la santé accorde R01 AI071727 (AO) et R01 GM110052 (SLV).
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Riferimenti
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