Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
Das Strukturprotein von HIV-1, Pr55 Gag (oder Gag), bindet an die Plasmamembran in Zellen während der Virus – Montageprozesses. Membranbindung von Gag ist ein wesentlicher Schritt für die Viruspartikelbildung, da ein Defekt in Gag Membranbindungs führt zu einer starken Beeinträchtigung der viralen Partikelproduktion. Zu gewinnen sind mechanistischen Details Gag-Lipid – Membran – Wechselwirkungen in vitro – Verfahren basiert auf NMR, Protein Fußabdrucks, Oberflächen – Plasmonresonanz, Liposom – Flotation Zentrifugation oder Fluoreszenz Lipid Wulst Bindung so weit entwickelt. Jedoch jede dieser di – vitro – Verfahren hat seine Grenzen. Um einige dieser Beschränkungen und bieten einen komplementären Ansatz zu den bisher etablierten Methoden zu überwinden, entwickelten wir ein di – vitro – Test , bei dem Interaktionen zwischen HIV-1 Gag und Lipidmembranen finden in einem "zellähnlichen" Umfeld. In diesem Test wird die Bindung an Gag Lipidmembranen visuell analysiert YFP-Tagged Gag in einem Weizen synthetisierten Keim-basierten in vitro – Translationssystem und GUVs durch eine Elektroformation Technik hergestellt. Hier beschreiben wir den Hintergrund und die Protokolle myristoylierten voller Länge Gag Proteinen und GUV Membranen, die für den Assay zu erhalten, und Gag-GUV Bindung durch Mikroskopie zu detektieren.
Introduction
Human Immunodeficiency Virus Typ 1 (HIV-1) ist ein umhülltes Virus, das an und Knospen aus der Plasmamembran (PM) in den meisten Zelltypen assembliert. Die Montage von HIV-1 – Viruspartikel wird durch das 55 kDa viralen Kernprotein genannt Pr55 Gag (gag) angetrieben. Gag wird als ein Vorläufer-Polyproteins synthetisiert besteht aus vier Hauptstrukturdomänen, nämlich, matrix, Capsid, Nucleocapsid und p6 sowie zwei Distanz Peptide SP1 und SP2. Bei der Montage ist die Matrix (MA) Domäne verantwortlich für die Ausrichtung der Gag an den Montageort, das Kapsid (CA) Domäne Gag-Gag-Interaktionen vermittelt, rekrutiert der Nucleocapsid (NC) Domäne virale genomische RNA und p6 Rekruten Wirtsfaktoren, dass die Hilfe Viruspartikel scission aus der Plasmamembran. Gag erfährt auch eine co-translationale Modifikation durch die Zugabe einer 14-Kohlenstoff-Fettsäure oder Myristat-Rest an seinem N-Terminus.
Membranbindung von Gag ist eine wesentliche Voraussetzung für die virale Montage, da mutants, die defekt in der Membran sind verbindlich versagen Viruspartikel zu erzeugen. Wir und andere haben gezeigt, dass die Membranbindung von Gag dargestellt durch bipartite Signale innerhalb der MA-Domäne vermittelt wird: die N-terminalen Myristat-Einheit, die mit der Lipid-Doppelschicht und einem Cluster basischer Reste innerhalb der MA-Domäne bezeichnet als stark basische Region hydrophober Wechselwirkungen vermittelt ( HBR) , die mit sauren Lipiden auf der PM 1-4 zusammenwirkt. Studien der Gag-Membran – Wechselwirkungen unter Verwendung ektopische Expression von Polyphosphoinositid 5-phosphatase IV (5ptaseIV), ein Enzym, das die Hydrolyse von PM-spezifische saure Phospholipid phosphatidylinositol- (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] katalysiert zu Phosphatidylinositol-4-phosphat, schlug in Zellen , die Gag-PM Lokalisierung von PI (4,5) P 2 3,5 vermittelt wird. Jedoch, mit dem Ziel di – vitro – Studien auf das Verständnis mehr mechanistischen Details Gag-PI (4,5) P 2 Wechselwirkungen haben bewiesen , für eine Reihe von Gründen in Frage zu stellen. FürBeispiel Reinigung von voller Länge myristoyliert HIV-1 Gag für biochemische Experimente hat sich zumindest teilweise aufgrund der Tendenz von Gag technisch schwierig während der Reinigung zu aggregieren. Daher verkürzte Formen von HIV-1 Gag, wie Myr-MA oder Myr-MA-CA, oder das nicht-myristoylierten Form häufig in Untersuchungen verwendet wurden , die Gag – Reinigung ( zum Beispiel Kernspinresonanz, Protein footprinting erfordern und Oberflächen Plasmonresonanz 6-9). Alternativ gekoppelt ist , in vitro Transkriptions-Translations – Reaktionen verwendet wurden , 1,2 voller Länge myristoyliert HIV-1 Gag in andere biochemische Studien herzustellen. Typischerweise in diesem System wird ein Gag-kodierenden Plasmid wird mit eukaryotische Zelllysate (zB Kaninchen – Retikulozyten – Lysaten) , die frei von jeglicher Zellmembranen und messenger RNAs transkribiert und translatiert , sondern die Maschinen für die Transkription und Translation enthalten. Nach der Reaktion enthält Gag Zelllysate werden bei mir gemischtmbranes zur Analyse von Gag Wechselwirkungen mit Lipiden. Zusätzlich zu der Leichtigkeit , mit voller Länge zur Herstellung myristoyliert Gag, Methoden der in vitro Transkriptions – Translations – System verwenden , haben den Vorteil , dass Gag – Synthese und nachfolgende Membranbindungsreaktionen in einem "eukaryotischen Cytosol-like 'Milieu auftreten , die eine bessere physiologische Bedingungen darstellen. Diese Eigenschaft trug den Studien zu , die zeigten , dass RNA – Moleküle an die MA – Domäne gebunden regulieren Gag in kompetitiver Weise 1,2,10-12 zu saure Lipide zu binden. Da jedoch in diesen Zellysaten die Gesamtmenge der Gag-Proteine erhalten werden, nicht hoch ist, ist die metabolische Markierung von Proteinen mit radiomarkierten Aminosäuren für deren Nachweis notwendig.
Je nach Methode Gag-Lipid-Wechselwirkungen zu messen, eine Vielzahl von Membranpräparationen verwendet wurden. Jede dieser Methoden hat ihre Stärken und Schwächen. Die meisten NMR-basierte Assays erfordern die Verwendung von Lipiden mit kurzen acylKetten , die wasserlösliche (zB C4- und C8-PI (4,5) P 2) 6,8 sind. Während NMR Methoden Bindung von Gag zu den Lipiden zu testen , die in Zellen gefunden langen Acylketten aufweisen entwickelt werden, haben sie bisher nur mit 8,13 myristoylierten oder nonmyristoylated MA verwendet. Alternativ Liposomen aus Lipiden , die native Länge Acylketten haben wurden in biochemischen Methoden wie Liposomen Flotation oder fluoreszierende Liposom Perle Bindungsassays 2,3,10,14-16 verwendet. Jedoch in diesen Assays verwendeten Liposomen haben kleine Durchmesser, und somit deren Membranen haben steile und positive Krümmungen. Im Gegensatz dazu ist während der frühen Phase der Partikelanordnung in HIV-1-infizierten Zellen bindet Gag an die PM, die nahezu auf der Skala von Gag planar und induziert anschließend negative Krümmung während Knospung. Daher Liposomenmembranen mit steilen und positive Krümmung vielleicht nicht ideal Lipid-Doppelschichten zu Gag-Lipid-Wechselwirkungen untersuchen. Wie für Liposom flichtation Assays ist eine weitere mögliche Einschränkung, dass die Exposition von Gag-Lipid-Komplexen zu hypertonischen Saccharosegradienten während der Zentrifugation die experimentellen Ergebnisse beeinflussen können. Um diese Einschränkungen zu mildern und ein komplementäres experimentelles System bereitstellen, Assays für die Bindung an Gag giant unilamellaren Vesikeln (GUV), wurden in den letzten Jahren entwickelt. GUVs sind einzelne Lipid-Doppelschicht-Vesikel, deren Durchmesser erstrecken sich bis zu mehreren zehn Mikrometern. Somit gleicht die Krümmung dieser Membranen der PM auf der Skala von Gag. Außerdem ist es aufgrund seiner großen Größe, die unter optischen Mikroskopen Sichtprüfung ermöglicht, Binde- Membran von fluoreszenz getaggt oder markiert Gag-Proteine dieser Vesikel beim Mischen kann leicht ohne nachfolgende Verarbeitung Gag-Lipid-Komplexe bestimmt werden.
Wir beschreiben hier ein Protokoll HIV-1 Gag Membran zu untersuchen Bindung mit GUVs von einem Elektroformation Verfahren erhalten. Verschiedene Methoden wie sanfte Feuchtigkeit, Gel-unterstützte Trink, microfluidic Jetting und Elektroformation 17-22 wurden verwendet GUVs zu erhalten. Für das hier beschriebene Protokoll wird die Elektroformation Verfahren in erster Linie wegen seiner Effizienz bei der Bildung GUVs mit sauren Lipiden und seine relative Einfachheit der Verwendung, ohne die Notwendigkeit von teuren Aufbauten verwendet. Da die Visualisierung von Gag ein fluoreszierendes Reporter erfordert, ist genetisch gelb fluoreszierendes Protein (YFP) an den C-Terminus von Gag (Gag-YFP) zugegeben. Gag-YFP Proteine werden durch in vitro Transkriptions- und Translationsreaktionen in wheat germ Lysaten erhalten auf der Basis der kontinuierlichen Austausch kontinuierlichen Strömung (CECF) Technologie. In dieser Technologie wird sowohl die Entfernung von inhibitorischen Nebenprodukte der Reaktionen und Zufuhr von Reaktionssubstraten und Energiekomponenten sind in einer Dialysebasierten Mechanismus erreicht. Bei diesen Reaktionen wird ein Plasmid, kodierend Gag-YFP unter der Kontrolle eines T7-Promotors verwendet. Bemerkenswert ist , wie bereits gezeigt, Weizenkeim Lysaten unterstützen Myristoylation ohne zusätzliche Komponenten 23,24. Myristoyliert Gag-YFP zur Visualisierung von Gag auf GUV Membranen 24 Mit dieser Methode war es möglich , ausreichende Mengen an in voller Länge zu erhalten. Hier beschreiben wir das Protokoll , mit dem HIV-1 Gag zu PI – Bindung (4,5) P 2 -haltigen GUV Membranen können ohne langwierige nachfolgende Verarbeitung folgende Bindungsreaktionen untersucht und schlagen vor , dass diese Methode bereits existierenden Gag-Membran – Bindungstests ergänzt und kann sein erweitert, um weitere Bindung HIV-1 Gag-Membran zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der GUV-Bindungstest, wie oben beschrieben stellt eine gute Alternative in Szenarien, in denen andere Protein-Lipid-Interaktion Tests haben ihre Grenzen. Dieser Test ermöglicht es uns, mit nativen Länge Acylketten in der Lipiddoppelschicht Kontext und zwar ohne langwierige Flotation Zentrifugation durch mit hoher Dichte Saccharosegradienten oder andere post-Bindung Verarbeitung von Gag-Lipid-Wechselwirkungen zwischen myristoylierten voller Länge Gag und saure Lipide zu untersuchen Komplexe. Ein weiterer Vorteil ist ,…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten, dass Mohammad Saleem, Jing Wu und Krishnan Raghunathan für hilfreiche Diskussionen. Wir danken auch Priya Begani für die Unterstützung während der Dreharbeiten. Diese Arbeit wird von National Institutes of Health gewährt R01 AI071727 (AO) und R01 GM110052 (SLV) unterstützt.
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Riferimenti
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