거대한 단일 층 소포 (GUV) 막 바인딩 HIV-1 개그의 시각화
Summary
We illustrate here an in vitro membrane binding assay in which interactions between HIV-1 Gag and lipid membranes are visually analyzed using YFP-tagged Gag synthesized in a wheat germ-based in vitro translation system and GUVs prepared by an electroformation technique.
Abstract
HIV-1의 구조 단백질 Pr55 개그 (또는 개그)는 바이러스 조립 과정에서 세포의 세포막에 결합한다. 개그 결합 막은 바이러스 입자 생산에 심각한 손상 개그 막 결합 결과 결함 사람 바이러스 입자 형성을위한 필수 단계이다. 개그 지질 막 상호 작용 기전 상세을 얻기 위해, 시험 관내 방법은 NMR, 단백질 배출량 측정, 표면 플라즈몬 공명, 리포솜 부유 원심 분리 또는 형광 지질 비드에 기초하여 지금까지 개발 된 바인딩. 그러나, 이러한 시험 관내 방법은 각각의 한계를 갖는다. 이러한 한계들을 극복하고 이전에 설정된 방법에 보완적인 접근 방식을 제공하기 위해, 우리는 HIV-1 개그 지질 세포막 사이의 상호 작용은 "셀 같은"환경에서 개최되는 시험 관내 (in vitro) 분석을 개발했다. 이 분석에서, 개그 지질막 결합 시각적 YFP-tagge를 사용하여 분석D 개그 밀 합성 관내 번역 시스템 및 전기 주조 기술에 의해 제조 GUVs에서 세균 계. 여기에서 우리는 배경을 설명하고 프로토콜 분석에 필요한 myristoylated 전체 길이 개그 단백질과 GUV 막을 얻고 현미경으로 결합 개그-GUV를 검색 할 수 있습니다.
Introduction
인간 면역 결핍 바이러스 타입 1 (HIV-1) 대부분의 세포 유형에에서 조립 및 플라즈마 막 (PM)에서 싹 포락선 바이러스입니다. HIV-1 바이러스 입자의 어셈블리가 Pr55 개그 (개그)라고하는 55 kDa의 바이러스 코어 단백질에 의해 구동된다. 개그는 네 개의 주요 구조 영역, 즉 매트릭스, 캡시드, 뉴 클레오 캡시드 및 P6뿐만 아니라, 두 개의 스페이서 펩티드 SP1 및 SP2로 이루어지는 전구체 폴리 단백질로서 합성된다. 조립시, 매트릭스 (MA) 도메인 어셈블리 사이트 개그 타겟팅 할 책임이 캡시드는 (CA)가 도메인 개그-개그 상호 작용을 매개하는, 뉴 클레오 캡시드 (NC) 영역은 바이러스 게놈 RNA를 모집하고 P6 모집 호스트 요인이 처치 세포막에서 바이러스 입자 분열. 개그는 또한 N 말단에 14 개의 탄소 지방산 또는 미리 스틴 산 잔기의 첨가에 의해 공동 번역 후 변형을 겪는다.
개그의 결합 멤브레인 m 이후, 바이러스 조립에 필수적인 요구 사항입니다결합 막 중의 결함 utants 바이러스 입자를 생산하지 못한다. 지질 이중층 높은 기본 영역으로 불리는 석사 도메인 내에서 기본 잔류 물의 클러스터 (과 소수성 상호 작용을 매개 N- 말단 미리 스테이트 부분 : 우리와 다른 사람은 MA 도메인 내에서 양자 신호에 의해 매개된다 개그의 결합이 막 보여 주었다 PM을 1-4 산성 지질과 상호 작용 HBR). polyphosphoinositide 5 포스 파타 아제 IV (5ptaseIV), PM-특정 산성 인지질 phosphatidylinositol-의 가수 분해를 촉매하는 효소의 자궁외 표현을 사용 개그 멤브레인의 상호 작용 연구 (4,5) -bisphosphate [PI (4,5) P 2] 포스파티딜 이노시톨-4 인산로, 세포에 개그-PM 현지화가 PI (4,5) P (2) 3,5에 의해 매개되는 것을 제안했다. 그러나, 시험 관내 연구 개그-PI (4,5) P의 더 자세한 기전을 이해 목표이 상호 작용은 여러 가지 이유로 도전적 입증되었다. 에 대한예, 생화학 실험 전체 길이의 정화 myristoylated HIV-1 개그 인해 정제 동안 집계 개그의 경향에 적어도 부분적으로 기술적으로 어렵다. 따라서, 이러한 MYR-MA 또는 MYR-MA-CA 또는 비 myristoylated 형태와 같은 HIV-1 개그의 절단 된 형태는 자주 개그 정제를 필요 연구에서 사용되어왔다 (예를 들면, 핵 자기 공명, 단백질 배출량 측정 및 표면 플라즈몬 공명 6-9). 대안 적으로, 시험 관내 전사 번역 반응에 연결된 다른 생화학 연구 1,2- 전체 길이 myristoylated 개그 HIV-1을 제조하는데 사용되어왔다. 일반적으로이 시스템에서, 개그 인코딩 플라스미드는 전사하고 세포막과 메신저 RNA를 결여하지만 전사 및 번역 기계를 포함하는 진핵 세포 용 해물 (예를 들면, 토끼 망상 해물)로 변환됩니다. 반응 후, 개그를 함유하는 세포 용 해물은 나와 혼합지질과 개그의 상호 작용 분석을위한 mbranes. 개그 myristoylated 전장의 제조 용이성에 더하여, 시험 관내 전사 번역 시스템을 사용하는 방법은 개그 합성 후의 막 결합 반응이 더 생리적 조건을 나타낼 수있는 '진핵 세포질 형'환경에서 발생하는 장점을 갖는다. 이 속성은 MA 도메인에 바인딩 RNA 분자가 개그가 경쟁 방식으로 1,2,10-12에 산성 지질에 결합 규제 것을 보여 주었다 연구에 기여했다. 이러한 세포 용 해물에서 얻은 개그 단백질의 총량이 높지 않기 때문에, 방사성 표지 된 아미노산과 단백질의 대사 표지는 검출이 필요하다.
상기 방법에 따라하기 개그 지질 상호 작용을 측정하기 위해, 막 제제의 다양한 사용되어왔다. 각 방법은 장점과 한계가있다. 대부분 NMR 기반 분석법 짧은 아실 지질의 사용을 필요수용성 (예를 들면, C8-C4- 및 PI (4,5) P 2) 6,8-있다 체인. NMR 방법들이 개발되고있는 세포에서 발견 긴 아실 체인을 갖는 지질 개그에 결합하는 것을 테스트하는 동안, 지금까지 8, 13 만 myristoylated 또는 nonmyristoylated MA로 사용되어왔다. 대안으로, 기본 길이 아실 체인을 지질로부터 제조 된 리포솜은 리포솜 부유 형광 리포솜 비드 결합 분석 2,3,10,14-16 같은 생화학 적 방법에 사용되어왔다. 그러나 이러한 분석에 사용 된 리포좀은 작은 직경을 가지며, 따라서, 이들 막은 가파른 포지티브 곡률을 갖는다. 반대로, HIV-1 감염 세포에서 입자 조립체의 초기 단계 동안, 개그 거의 개그의 규모에 평면이 상기 PM에 결합하고,이어서 신진 중에 네거티브 곡률을 유도한다. 따라서, 가파른 긍정적 인 곡률 리포솜 막은 개그 지질 상호 작용을 연구하는 이상적인 지질 이중층하지 않을 수 있습니다. 리포좀 FLOT에 관해서ATION 분석, 다른 잠재적주의해야 할 점은 실험 결과에 영향을 미칠 수있는 원심 분리 동안 고장 성 자당 기울기에 개그 지질 복합체의 노출이다. 이러한 제한을 완화하고 보완 실험 시스템을 제공하기 위해, 개그가 거대한 단일 층 소포 (GUVs)에 결합에 대한 분석은 최근에 개발되었다. GUVs는 그 직경이 수십 마이크로 미터까지 연장 단일 지질 이중층 소포이다. 따라서, 이러한 세포막의 곡률은 개그의 규모에 PM 유사합니다. 또한, 때문에 광학 현미경 하에서 육안 검사를 할 수 있습니다 대형 크기로 막 쉽게 개그 지질 복합체의 후속 처리없이 결정할 수있다 혼합에이 소포에의 찬란 태그 또는 라벨 개그 단백질을 결합.
우리는 여기에 전기 주조 방법에서 얻은 GUVs를 사용하여 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 연구하는 프로토콜을 설명합니다. 같은 부드러운 수화 젤 이용한 수화, 마이크 등의 다양한 방법rofluidic 분사하고, 전기 주조는 17-22 GUVs을 얻기 위해 사용되었다. 여기에 설명 된 프로토콜의 경우, 전기 주조 방법은 산성 지질 비싼 설정 없이도 사용의 비교적 쉽게 형성 GUVs 주로 때문에 효율이 사용된다. 개그의 시각화 형광 기자를 필요로하기 때문에, 노란색 형광 단백질 (YFP)는 유 전적으로 개그 (개그-YFP)의 C 말단에 추가됩니다. 개그-YFP 단백질 연속 교환 연속 흐름 (CECF) 기술을 기반으로 밀 배아 용해질에서 시험 관내 전사 및 번역 반응에 의해 얻어진다. 이 기술에서, 반응은 반응 기질 및 에너지 구성 요소의 공급을 억제 부산물을 모두 제거하여 투석 기반기구에서 달성된다. 이들 반응 들면, T7 프로모터의 제어하에 개그-YFP를 코딩하는 플라스미드가 사용된다. 이전과 같이 참고로, 밀 배아 해물을 추가 구성 요소 (2)를하지 않고 미리 스토 일화를 지원3,24. 이 방법을 사용하면, GUV 막 (24)의 개그 시각화 개그-YFP myristoylated 전체 길이의 충분한 양을 얻을 수있다. 여기서 우리는 HIV-1 개그가 PI에 결합되는 프로토콜을 설명 (4,5) P 2 GUV 막을 함유하는 결합 반응을 다음과이 방법은 결합 분석을 기존의 개그 멤브레인을 보완 할 수 있다는 제안 긴 후속 처리없이 검사 할 수 또한 결합 HIV-1 개그 멤브레인을 이해하는 확장.
Protocol
Representative Results
Discussion
상술 한 바와 같이 GUV 결합 분석은 다른 단백질 지질 상호 작용을 분석 자신의 한계를 가지고 시나리오에서 좋은 대안을 제공합니다. 이 분석은 우리가 지질 이중층의 맥락에서 기본 길이 아실 체인 myristoylated 전체 길이 개그 산성 지질 사이의 상호 작용을 검토하고 개그 지질의 고밀도 자당 그라디언트 또는 다른 후 바인딩 처리를 통해 긴 부상 원심 분리없이 그렇게 할 수 있습니다 단지. 또 다?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 도움이 토론 모하메드 살림, 징 우 및 Krishnan Raghunathan에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는 또한 촬영하는 동안 도움을 프리 야 Begani 감사합니다. 이 작품은 (AO에) R01 AI071727 및 (SLV에) R01 GM110052은 건강의 국립 연구소에 의해 부여 지원됩니다.
Materials
| Digital Multimeter | Meterman | 30XR | A generic multimeter that can measure resistance and volts will serve the purpose. |
| Function Generator | Instek | GFG-8216A | A generic function generator that is capable of generating a sine wave at 10hz and 1V is sufficient. |
| ITO coated glass slides | Delta Technologies, Loveland, CO | CG-90IN | |
| Incubator | Hoefer | Any incubator that can accurately maintain temperature will be sufficient | |
| Vacuum chamber | Nalgene | ||
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Syringe | Hamilton | 80400 | Gauge 22S, Syringe number 702 |
| PDMS | Sylgard elastomer base kit, Dow-Corning | Sylgard, 184 | |
| RTS 100 Wheat Germ CECF Kit | BiotechRabbit, Berlin, Germany |
BR1401001 | |
| DiD | Life Technologies, Carlsbad, CA | D7757 | |
| POPC | Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL | 850457C | |
| POPS | Avanti Polar Lipids | 840034C | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700041P | |
| Brain-PI(4,5)P2 | Avanti Polar Lipids | 840046X |
Riferimenti
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