Imaging fluorescente combinata vicino infrarosso e la tomografia micro-computerizzata per Direttamente Visualizzazione cerebrale tromboembolie
Summary
Questo protocollo descrive l'applicazione della tomografia combinata a fluorescenza nel vicino infrarosso (NIRF) imaging e micro-computerizzata (microCT) per la visualizzazione tromboembolie cerebrale. Questa tecnica consente la quantificazione del carico trombotico ed evoluzione. La tecnica di imaging NIRF visualizza fluorescente trombo nel cervello asportato, mentre la tecnica microCT visualizza trombo all'interno gli animali viventi utilizzando oro-nanoparticelle.
Abstract
l'imaging diretto trombo visualizza la causa principale di infarto tromboembolica. Essere in grado di immagine trombo permette direttamente di gran lunga migliore ricerca di ictus che basarsi su misure indirette, e sarà uno strumento potente e robusto ricerca vascolare. Usiamo un approccio di imaging ottico che etichetta trombi con un pennarello l'imaging molecolare trombo – una sonda fluorescente Cy5.5 vicino infrarosso (NIRF) che è legata covalentemente ai filamenti di fibrina del trombo dall'azione enzimatica fibrina reticolazione di attivazione fattore della coagulazione XIIIa durante il processo di maturazione coagulo. Un micro-tomografia computerizzata (microCT) approccio basata su utilizza nanoparticelle di oro trombo-seeking (AuNPs) funzionalizzati di indirizzare il componente principale del coagulo: fibrina. Questo documento descrive un protocollo dettagliato per la combinata in vivo microCT e ex vivo l'imaging NIRF di tromboembolie in un modello murino di ictus embolico. Abbiamo dimostrato che in vivo </ em> microCT e AuNPs glicole-chitosano fibrina mirati (FIB-GC-AuNPs) può essere utilizzato per la visualizzazione sia in situ trombi e cerebrale trombi embolico. Descriviamo anche l'uso di imaging in vivo trombo diretta microCT-based per monitorare serialmente gli effetti terapeutici del plasminogeno tissutale trombolisi attivatore-mediata. Dopo l'ultima sessione di imaging, dimostriamo da ex vivo NIRF imaging la portata e la distribuzione di tromboembolie residua nel cervello. Infine, si descrive l'immagine di analisi quantitative e microCT NIRF dati di imaging. La tecnica combinata di immagini dirette trombo permette due metodi indipendenti di visualizzazione trombo da confrontare: l'area del segnale fluorescente trombi correlati a ex vivo NIRF l'imaging rispetto al volume di iperdensa microCT trombi in vivo.
Introduction
Uno in 6 persone avranno un ictus a un certo punto nella loro vita. Ictus ischemico è di gran lunga il tipo di tratto più comune, e rappresenta circa il 80 per cento di tutti i casi di ictus. Perché tromboembolie causano la maggior parte di questi ictus ischemico, vi è un crescente interesse per l'imaging diretto trombo.
E 'stato stimato che circa 2 milioni di cellule cerebrali muoiono durante ogni minuto di cerebrale media occlusione dell'arteria 1, che porta lo slogan "Il tempo è cervello". La tomografia computerizzata (CT) studi può essere fatto rapidamente, e sono ampiamente disponibili; Per questo motivo, CT rimane il imaging di scelta per la diagnosi e il trattamento di ictus ischemico iperacuto iniziale. CT è particolarmente utile per informare le prime decisioni critiche: la somministrazione di attivatore tissutale del plasminogeno (tPA) per trombolisi e / o triaging a endovascolare coagulo-recupero 2. Attuale CT-based Imaging trombo, tuttavia, non può in serie monitorare cerebral tromboembolie in vivo, perché utilizza metodi indiretti per dimostrare trombi: dopo opacizzazione della pozza di sangue da parte di contrasto iodati, il trombi sono dimostrati come difetti di riempimento nei vasi. Ci sono limiti di dose ei rischi associati con la somministrazione ripetuta di contrasto iodato, che precludono ripetono l'imaging di trombi in questo modo.
Pertanto, vi è una necessità critica per una metodologia di imaging diretto trombi cerebrale nei pazienti con ictus, per consentire più veloce e migliori decisioni di trattamento da effettuare. Noi proponiamo di ottenere questo risultato, migliorando il valore del CT, la modalità di imaging prima linea attualmente utilizzata per il colpo, con l'uso di un agente di imaging molecolare nanoparticular trombo-seeking.
Abbiamo dimostrato l'uso di questo agente utilizzando micro-tomografia computerizzata (microCT), ad alta risoluzione ex vivo o in vivo (piccoli animali) la versione per immagini della TC che permette l'acquisizione rapida di dati <sup> 3,4. Anche con il relativamente scarso contrasto dei tessuti molli a disposizione per le piccole microCT animali (molto peggio di quanto disponibili da scanner umani imprese), l'agente di imaging è stato in grado di cercare e contrassegnare trombi facendoli iperdensa alla TC, un 'segno nave densa' arricchito da molecolare imaging.
A complemento della tecnica CT, il nostro gruppo ha già messo a punto una tecnica di imaging trombo diretta ottica utilizzando la sonda fluorescente Cy5.5 nel vicino infrarosso (NIRF) di visualizzare cerebrale trombo onere 5. Questa è una tecnica ex vivo sul cervello post mortem, ma è molto sensibile, e serve a confermare dati in vivo nella cornice di ricerca.
Avendo entrambi TC e NIRF basano tecniche di imaging trombo-seeking ci permette di confrontare e contrapporre queste tecniche per ottenere i dati altamente informativi sul ruolo di trombi e di imaging trombo nel processo di sviluppo ictus ischemico.
Here, descriviamo un protocollo dettagliato di una tecnica combinata di microCT in vivo e ex vivo l'imaging NIRF di visualizzare direttamente tromboembolie in un modello murino di ictus embolico. Questi metodi semplici e robusti sono utili per migliorare la nostra comprensione delle malattie trombotiche consentendo l'accurata nella valutazione vivo di trombi carico / distribuzione e caratterizzazione dell'evoluzione trombo dinamica in modo rapido e quantitativa in vivo durante la terapia, seguita da ex vivo dati che serve come controllo e standard di riferimento per la conferma dei risultati di imaging in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Abbiamo dimostrato l'uso di due complementari molecolari tecniche di imaging per l'imaging trombo diretta in modelli sperimentali di ictus embolico: un fibrina mirata nanoparticelle d'oro (FIB-GC-AUNP) per l'imaging microCT-based in vivo, e un FXIIIa mirato sonda di imaging ottico per ex vivo per immagini a fluorescenza.
Dopo somministrazione endovenosa di fib-GC-AuNPs, trombi divenne visibile alla TC come strutture dense, causata dalle particelle diventando…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla Corea Healthcare Technology R & S del progetto, Ministero della Salute e del Welfare (HI12C1847, HI12C0066), il Programma di Bio & Medical Technology Development (2.010-0.019.862) e programma di Global Research Lab (GRL) (NRF-2015K1A1A2028228) del Fondazione nazionale delle Ricerche, finanziato dal governo coreano.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
Riferimenti
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