직접 대뇌 Thromboemboli 시각화를위한 결합 된 근적외선 형광 이미징 및 마이크로 계산 된 단층 촬영
Summary
이 프로토콜은 대뇌 thromboemboli을 시각화 결합 된 근적외선 형광 (NIRF) 이미징 및 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT)의 응용 프로그램을 설명합니다. 이 기술은 혈전 부담과 진화의 정량화 할 수 있습니다. microCT 기술은 금 나노 입자를 사용하여 살아있는 동물 내부 혈전 가시화하면서 NIRF 이미징 기술은 형광 절제 뇌 혈전 표지 가시화.
Abstract
다이렉트 이미징 혈전 색전증 경색의 근본 원인을 시각화한다. 이미지 혈전을 수있는 것은 직접 간접 측정에 의존보다 뇌졸중의 훨씬 더 조사를 허용하고, 강력하고 강력한 혈관 연구 도구가 될 것입니다. 우리는 분자 이미징 혈전 마커 혈전 라벨 광학 이미징 방법을 사용 – 공유 응고 성숙 과정에서 활성화 응고 인자의 XIIIa에 피브린 – 가교 효소 작용에 의해 혈전 섬유소 가닥에 연결된 Cy5.5 근적외선 형광 (NIRF) 프로브. 섬유소 : 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT) 기반의 접근 방식은 혈전의 주요 구성 요소를 대상으로 작용 혈전을 추구하는 금 나노 입자 (AuNPs)를 사용합니다. 본 논문은 생체 microCT 결합 및 색전 뇌졸중의 마우스 모델에서 thromboemboli의 생체 NIRF 이미징에 대한 상세한 프로토콜을 설명합니다. 우리는 생체 내에서 보여 </ EM>는 microCT 및 섬유소 타겟 글리콜 키토산 AuNPs은 (FIB는-GC-AuNPs)는 현장 혈전 및 색전 뇌 혈전에 모두 시각화에 사용할 수 있습니다. 또한 직렬 조직 플라스 미노 겐 활성제 매개 혈전 용해의 치료 효과를 모니터링하는 생체 microCT 기반 직접 혈전 영상의 사용을 설명한다. 마지막 이미징 세션 후, 우리는 생체 NIRF의 범위와 뇌의 잔류 thromboemboli의 분포를 영상화하여 보여줍니다. 마지막으로, 우리는 양적 이미지가 microCT 및 NIRF 영상 데이터의 분석에 대해 설명합니다. 직접 혈전 영상의 결합 기술은 혈전 시각화의 두 개의 독립적 인 방법을 비교 할 수 있습니다 :에 혈전 관련 형광 신호의 영역 생체 NIRF 이미징 대 생체 내에서 한 고밀도의 microCT 혈전의 볼륨.
Introduction
육명에 하나는 자신의 일생에 어떤 시점에서 뇌졸중이있을 것이다. 허혈성 뇌졸중은 지금까지 가장 일반적인 뇌졸중의 종류에 따라, 그리고 모든 스트로크의 경우 약 80 %를 차지한다. thromboemboli이 허혈성 뇌졸중의 대부분의 원인이되기 때문에, 바로 촬상 혈전에 대한 관심이 높아지고있다.
그것은 약 2 백만 뇌 세포는 슬로건 "시간이 두뇌입니다"로 이어지는 중간 대뇌 동맥 폐쇄 1의 모든 분 동안 죽을 것으로 추정했다. 전산화 단층 촬영 (CT) 연구는 신속하게 수행하고 널리 사용할 수 있습니다 될 수있다; 이러한 이유로, CT는 초기 진단 및 초급 성 허혈성 뇌졸중의 치료를위한 선택의 영상 남아있다. 혈전 용해에 대한 조직 플라스 미노 겐 활성제 (TPA)을 관리 및 / 또는 혈관 내 혈전 검색 2 차적으로 분류 : CT는 중요한 초기 의사 결정을 알리는 데 특히 유용합니다. 현재 CT 기반 혈전 이미징, 그러나, 직렬 cerebra을 추적 할 수 없습니다생체 내에서 리터의 thromboemboli, 그것은 간접적 인 방법을 사용하기 때문에이 혈전을 설명합니다 : 요오드화 대비하여 혈액 풀의 혼탁 한 후, 혈전은 혈관의 결함을 충전으로 증명된다. 이와 같이 혈전 촬상 반복 곤란할 요오드화 콘트라스트의 반복 투여와 관련된 용량 한계 위험이있다.
따라서, 빠르고 더 나은 치료 결정 할 수 있도록 뇌졸중 환자에서 뇌 혈전에 대한 직접 촬상 방법에 대한 중대한 필요성이있다. 우리는 혈전 추구 nanoparticular 분자 이미징 제의 사용으로, CT, 뇌졸중 현재 사용되고있는 전선 영상 기법의 값을 향상시켜이를 위해 제안한다.
우리는 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (microCT), 신속한 데이터 취득 <있게 고해상도 생체 외 또는 생체 내 (작은 동물) CT 영상의 버전을 사용하는 이러한 약제의 사용을 증명SUP> 3,4. 에도 (인간 크기의 스캐너에서 사용할 수보다 훨씬 더) 작은 동물 microCT에 사용할 수있는 상대적으로 가난한 연부 조직 대조, 이미징 에이전트가 추구하고 CT, 분자에 의해 향상된 '고밀도 용기 기호'에 그들에게 한 고밀도을 만들어 혈전을 표시 할 수 있었다 영상.
CT 기술을 보완 우리 그룹은 뇌 혈전 부담 5 시각화 Cy5.5 근적외선 형광 (NIRF) 프로브를 이용한 광 혈전 다이렉트 이미징 기술을 개발 이전 하였다. 이것은 사후 뇌 부검에 생체 외 기법이지만, 매우 민감하며, 연구 설정 생체 데이터에서 확인하는 역할을한다.
CT와 NIRF 모두 혈전을 추구하는 이미징 기술을 기반 갖는 것은 우리가 비교하고 허혈성 뇌졸중 개발의 과정에서 혈전 및 혈전 이미징의 역할에 크게 정보 데이터를 달성하기 위해 이러한 기술을 대조 할 수 있습니다.
H감수, 우리는 생체 내 및 생체 외 microCT NIRF 영상의 결합 기술에 대한 상세한 프로토콜은 직접 색 전성 뇌졸중의 쥐 모델에서 thromboemboli 시각화 기술한다. 이 간단하고 강력한 방법을 제공 생체 데이터 다음에, 치료 중 생체 내에서 신속하고 정량적 인 방법으로 혈전 부담 / 유통 및 동적 혈전 진화의 특성의 생체 내 평가에서 정확한을 활성화하여 혈전 질환에 대한 우리의 이해를 발전하는데 유용하다 생체 영상 소견의 확인에 대한 제어 및 참조 표준으로.
Protocol
Representative Results
Discussion
피브린은 생체 microCT 기반 이미징 금 나노 입자 (FIB-GC-AuNP)을 타겟팅하고 FXIIIa는 전 광학 이미징 프로브를 대상으로 우리는 색 전성 뇌졸중의 실험 모델에서 직접 혈전 촬상 두 상보 분자 이미징 기술의 사용을 보여 형광 이미징 생체 내.
FIB-GC-AuNPs의 정맥 내 투여 후 혈전 농도 그라데이션 – 후 (입자 표면에서) 피브린 타겟팅 펩타이드의 작용에 의해 혈전?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 한국 의료 기술 R & D 프로젝트, 보건 복지부 (HI12C1847, HI12C0066)에 의해 지원되었다, 바이오 및 의료 기술 개발 프로그램 (2010-0019862) 및 글로벌 연구실 (GRL) 프로그램의 (NRF-2015K1A1A2028228) 한국 정부에 의해 자금 국립 연구 재단.
Materials
| Machines | |||
| microCT | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | |
| NIRF imaging system | Roper-scientific,Tucson, AZ | coolsnap-Ez | |
| Laser Doppler flowmeter | Perimed, Stockholm, Sweden | PeriFlux System 5000 | |
| Surgical microscope | Leica Microsystems, Seoul, Korea | EZ4HD | |
| Inhalation anesthesia machine | PerkinElmer, Massachusetts, USA | XGI-8 | |
| Software | |||
| NFR control | NanoFocusRay, JeonJu, Korea | NFR Polaris-G90 | microCT control software |
| Lucion | Infinitt, Seoul, Korea | Lucion | 3D render imaging software |
| Lab chart 7 | ADInstruments, Colorado, USA | Lab chart 7 | rCBF |
| Image J software | Wanye Rasband, NIH, USA | 1.49d | imaging analysis |
| Devices/Instruments | |||
| Infusion pump | Harvard, Massachusetts, USA | pump 22(55-2226) | |
| Homeothermic blanket | Panlab, Barcelona, Spain | HB101 | |
| Pocket cautery | Daejong, Seoul, Korea | DJE-39 | |
| Brain matrice | Ted pella, CA, USA | 15003 | coronal section |
| PE-50 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-45(PE-50) | I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm |
| PE-10 tubing | Natsume, Tokyo, Japan | SP-10(PE-10) | I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm |
| 30 gauge needle | sungshim-medical, Seoul, Korea | ||
| Syringe | CPL-medical, Ansan, Korea | 1 & 3 cc | |
| Gauze | Panamedic, Cheonan, Korea | ||
| Tape | Scotch, Seoul, Korea | 3M-810 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 11253-27 | Dumont #L5 |
| Micro scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 15000-03 | Vannas spring |
| Scissor | Fine Science Tools, Vancouver, Canada | 14084-08 | 8.5 cm |
| Black silk suture | Ailee, Busan, Korea | SK6071, SK728 | 6-0 and 7-0 |
| Reagents | |||
| meloxicam | Yuhan, Seoul, Korea | ||
| vet ointment | Novartis, Basel, Swiss | ||
| 10% Povidone-iodine (betadine) | Firson, Cheon-an, Korea | ||
| FeCl3 | Sigma, Missouri, United States | 157740-5G | |
| TTC | Amresco, Ohio, USA | 0765-100g | |
| Isoflurane | Hana-Pham, Gyeonggi, Korea | Ifran | 100 mL |
| PBS | Welgene, Daegu, Korea | LB001-02 | 500 mL |
| Gold nanoparticles | Synthesis | ||
| C15 optical agent | Synthesis | ||
| Tissue plasminogen activator | Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany | rtPA(actilyse) | 20 mg |
| Normal saline | Daihan Pham, Seoul, Korea | 48N3AF3 | 20 mL |
Riferimenti
- Saver, J. L. Time is brain–quantified. Stroke. 37 (1), 263-266 (2006).
- Latchaw, R. E., et al. Recommendations for imaging of acute ischemic stroke: a scientific statement from the American Heart Association. Stroke. 40 (11), 3646-3678 (2009).
- Kim, D. E., et al. Hyperacute direct thrombus imaging using computed tomography and gold nanoparticles. Ann Neurol. 73 (5), 617-625 (2013).
- Kim, J. Y., et al. Direct Imaging of Cerebral Thromboemboli Using Computed Tomography and Fibrin-targeted Gold Nanoparticles. Theranostics. 5 (10), 1098-1114 (2015).
- Kim, D. E., et al. Direct thrombus imaging as a means to control the variability of mouse embolic infarct models: the role of optical molecular imaging. Stroke. 42 (12), 3566-3573 (2011).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
- Durukan, A., Tatlisumak, T., Fisher, M. Animal models of ischemic stroke. Handbook of clinical neurology: Stroke Part 1: Basic and epidemiological aspects.Volume 92. 92, 43-66 (2009).
- Overoye-Chan, K., et al. EP-2104R: a fibrin-specific gadolinium-Based MRI contrast agent for detection of thrombus. J Am Chem Soc. 130 (18), 6025-6039 (2008).
- Kim, D. E., Schellingerhout, D., Jaffer, F. A., Weissleder, R., Tung, C. H. Near-infrared fluorescent imaging of cerebral thrombi and blood-brain barrier disruption in a mouse model of cerebral venous sinus thrombosis. J Cereb Blood Flow Metab. 25 (2), 226-233 (2005).
- Tung, C. H., et al. Novel factor XIII probes for blood coagulation imaging. Chembiochem. 4 (9), 897-899 (2003).
- Robinson, B. R., Houng, A. K., Reed, G. L. Catalytic life of activated factor XIII in thrombi. Implications for fibrinolytic resistance and thrombus aging. Circulation. 102 (10), 1151-1157 (2000).
- Reed, G. L., Houng, A. K. The contribution of activated factor XIII to fibrinolytic resistance in experimental pulmonary embolism. Circulation. 99 (2), 299-304 (1999).
- Sun, I. C., et al. Biocompatible glycol chitosan-coated gold nanoparticles for tumor-targeting CT imaging. Pharm Res. 31 (6), 1418-1425 (2014).
- Celi, A., et al. Thrombus formation: direct real-time observation and digital analysis of thrombus assembly in a living mouse by confocal and widefield intravital microscopy. J Thromb Haemost. 1 (1), 60-68 (2003).
- Chen, I. Y., Wu, J. C. Cardiovascular molecular imaging: focus on clinical translation. Circulation. 123 (4), 425-443 (2011).
- Wintermark, M., et al. Imaging recommendations for acute stroke and transient ischemic attack patients: a joint statement by the American Society of Neuroradiology, the American College of Radiology and the Society of NeuroInterventional Surgery. J Am Coll Radiol. 10 (11), 828-832 (2013).
- Weissleder, R., Tung, C. H., Mahmood, U., Bogdanov, A. In vivo imaging of tumors with protease-activated near-infrared fluorescent probes. Nat Biotechnol. 17 (4), 375-378 (1999).
- Narayanan, S., et al. Biocompatible magnetite/gold nanohybrid contrast agents via green chemistry for MRI and CT bioimaging. ACS Appl Mater Interfaces. 4 (1), 251-260 (2012).
- Amendola, V., et al. Magneto-plasmonic Au-Fe alloy nanoparticles designed for multimodal SERS-MRI-CT imaging. Small. 10 (12), 2476-2486 (2014).
- Zhu, J., et al. Synthesis of Au-Fe3O4 heterostructured nanoparticles for in vivo computed tomography and magnetic resonance dual model imaging. Nanoscale. 6 (1), 199-202 (2014).
