Kombinert Nær-infrarød Fluorescent Imaging og Micro-computertomografi for Direkte Visualisering Cerebral tromboemboli

Summary

Denne protokollen beskriver bruk av kombinerte nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) bildebehandling og mikro-computertomografi (microCT) for å visualisere cerebral tromboemboli. Denne teknikken tillater kvantifisering av trombe byrde og evolusjon. Den NIRF avbildningsteknikk visualiserer fluorescensmerkede trombe i utskåret hjernen, mens microCT teknikken visualiserer trombe inne levende dyr med gullnanopartikler.

Abstract

Direkte trombusavbilding visualiserer rotårsak av tromboembolisk infarkt. Å være i stand til å bilde tromben tillater direkte langt bedre undersøkelse av slag enn å stole på indirekte målinger, og vil være en potent og robust vaskulær forskningsverktøy. Vi bruker en optisk avbildning tilnærming som etiketter tromber med en molekylær avbildning trombe markør – en Cy5.5 nær-infrarødt, fluorescent (NIRF) probe som er kovalent bundet til fibrin-tråder av tromben av fibrin-tverrbindings enzymatisk virkning av aktivert koagulasjonsfaktor XHIa under prosessen av blodpropp modning. En mikro-computertomografi (microCT) -basert tilnærmingen bruker trombe økende gullnanopartikler (AuNPs) funksjon å målrette den viktigste komponenten av blodpropp: fibrin. Dette dokumentet beskriver en detaljert protokoll for den kombinerte in vivo microCT og ex vivo avbildning av NIRF tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Vi viser at in vivo </ em> microCT og fibrin-målrettet glykol-kitosan AuNPs (fib-GC-AuNPs) kan brukes til å visualisere både in situ tromber og cerebral embolic tromber. Vi beskriver også bruken av in vivo microCT baserte direkte trombusavbilding til serielt overvåke den terapeutiske effekten av vevsplasminogenaktivator-mediert trombolyse. Etter siste bildebehandling økten, vi demonstrere ved ex vivo NIRF bildebehandling omfang og fordeling av rest tromboemboli i hjernen. Til slutt beskriver vi kvantitativ bildeanalyse av microCT og NIRF bildedata. Den kombinerte teknikk for direkte trombusavbilding tillater to uavhengige metoder for visualisering tromben som skal sammenlignes: arealet av trombe-relaterte fluorescerende signal på ex vivo avbildning NIRF lignet med volumet av hyperdense microCT tromber in vivo.

Introduction

Én av 6 personer vil ha et slag på et tidspunkt i livet. Hjerneinfarkt er langt den vanligste slag type, og står for om lag 80 prosent av alle slagtilfeller. Fordi tromboemboli forårsake de fleste av disse iskemisk slag, er det en økende interesse i direkte trombusavbilding.

Det ble anslått at om lag 2 millioner hjerneceller dør i løpet av hvert minutt av midt cerebral arterie okklusjon ^1, som fører til slagordet "Tid er Brain". Computertomografi (CT) undersøkelser kan gjøres raskt, og er allment tilgjengelig; på grunn av dette, CT forblir avbildning av valget for den innledende diagnose og behandling av hyperakutt hjerneinfarkt. CT er spesielt verdifull for å informere de kritiske tidlige beslutninger: administrere vevsplasminogenaktivator (tPA) for trombolyse og / eller triaging til endovaskulær blodpropp-henting ^2. Nåværende CT-baserte trombusavbilding, kan imidlertid ikke serielt spore cerebral tromboemboli in vivo, fordi den bruker indirekte metoder for å demonstrere tromber: etter opasifikasjon av blodet pool av joderte kontrast, er tromber demonstrert som fylling av feil i skipene. Det er dosegrenser og risiko forbundet med gjentatt administrasjon av joderte kontrast, som utelukker gjentatte avbildning av tromber på denne måten.

Det er derfor et kritisk behov for en direkte avbildning metodikk for cerebral blodpropper hos slagpasienter, for å tillate raskere og bedre behandling beslutninger for å bli gjort. Vi foreslår å oppnå dette ved å øke verdien av CT, den tiden brukes frontlinjen avbildningsfunksjonalitet for slag, med bruk av en trombe søkende nanoparticular molekylær avbildning agent.

Vi har vist at bruk av denne agenten ved hjelp av mikro-computertomografi (microCT), en høy oppløsning ex vivo eller in vivo (små dyr) avbildning versjon av CT som tillater rask datainnsamling <sup> 3,4. Selv med relativt dårlig bløtvev kontrast tilgjengelig for små dyr microCT (mye verre enn tilgjengelig fra menneskelig størrelse skannere), bilde agent var i stand til å søke og markere tromber ved å gjøre dem hyperdense på CT, en "tett fartøy skilt 'forsterket av molekylære bildebehandling.

Utfyller CT teknikken, har vår gruppe tidligere utviklet en optisk direkte trombusavbilding teknikk med Cy5.5 nær-infrarødt fluorescerende (NIRF) probe for å visualisere cerebral blodpropp byrde ^5. Dette er en ex vivo teknikk på post mortem hjerner, men er svært følsom, og tjener til å bekrefte in vivo data i forsknings setting.

Å ha både CT og NIRF basert trombe søkende imaging teknikker tillater oss å sammenligne og kontrast disse teknikkene for å oppnå svært informative data om rollen til tromben og trombusavbilding i ferd med iskemisk hjerneslag utvikling.

Here, beskriver vi en detaljert protokoll av en kombinert teknikk for in vivo microCT og ex vivo avbildning NIRF til direkte å visualisere tromboemboli i en musemodell av emboliske slag. Disse enkle og robuste metoder er anvendelige for å fremme forståelsen av trombotiske sykdommer ved å muliggjøre den nøyaktige in vivo vurdering av tromben byrde / fordelings og karakterisering av dynamisk trombe utvikling i en rask og kvantitativ måte in vivo i løpet av terapi, etterfulgt av ex vivo data som tjener som en kontroll og referansestandard for bekreftelse av in vivo avbildning funn.

Protocol

Alle dyr prosedyrer demonstrert i denne protokollen er gjennomgått og godkjent av Dongguk universitetet Ilsan Hospital Animal Care og bruk komité og utført i samsvar med prinsippene og prosedyrene som er beskrevet i Guide NIH for omsorg og bruk av dyr. 1. Utarbeidelse av eksogent Dannet Clot Merket med Fluorescence Marker (figur 1) Bedøve en mus i en induksjonskammeret ved anvendelse av 3% isofluran blandet med 30% oksygen (1,5 l / min 100% oksygen). Sørg for tilstrekkelig dybde av anestesi ved ?…

Representative Results

Baseline microCT bilder, oppnås in vivo etter administrering av fib-GC-AuNP (10 mg / ml, 300 ul) ved 1 time etter embolisk slag, tydelig visualisert cerebral trombose i MCA – ACA bifurkasjon område av den distale arteria carotis interna (Figur 6 ). Oppfølging microCT bildebehandling viste ingen endring i COW trombe med saltvann behandling. Men behandling med tPA viste en gradvis avvikling av COW tromben (blå pilspisser i Figur 6). Dette funn…

Discussion

Vi demonstrerte bruk av to komplementære molekylære bildeteknikker for direkte trombusavbilding i eksperimentelle modeller av embolisk slag: fibrin målrettet gull nanopartikkel (fib-GC-AuNP) for in vivo microCT basert bildebehandling, og en FXIIIa målrettet optisk avbildning probe for ex vivo fluorescerende bildebehandling.

Etter intravenøs administrering av fib-GC-AuNPs, ble tromber synlig for CT som tette strukturer, på grunn av at partiklene blir innfanget i det tr…

Materials

Machines
microCT	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90
NIRF imaging system	Roper-scientific,Tucson, AZ	coolsnap-Ez
Laser Doppler flowmeter	Perimed, Stockholm, Sweden	PeriFlux System 5000
Surgical microscope	Leica Microsystems, Seoul, Korea	EZ4HD
Inhalation anesthesia machine	PerkinElmer, Massachusetts, USA	XGI-8
Software
NFR control	NanoFocusRay, JeonJu, Korea	NFR Polaris-G90	microCT control software
Lucion	Infinitt, Seoul, Korea	Lucion	3D render imaging software
Lab chart 7	ADInstruments, Colorado, USA	Lab chart 7	rCBF
Image J software	Wanye Rasband, NIH, USA	1.49d	imaging analysis
Devices/Instruments
Infusion pump	Harvard, Massachusetts, USA	pump 22(55-2226)
Homeothermic blanket	Panlab, Barcelona, Spain	HB101
Pocket cautery	Daejong, Seoul, Korea	DJE-39
Brain matrice	Ted pella, CA, USA	15003	coronal section
PE-50 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-45(PE-50)	I.D. 0.58 mm O.D. 0.96 mm
PE-10 tubing	Natsume, Tokyo, Japan	SP-10(PE-10)	I.D. 0.28mm O.D. 0.61 mm
30 gauge needle	sungshim-medical, Seoul, Korea
Syringe	CPL-medical, Ansan, Korea		1 & 3 cc
Gauze	Panamedic, Cheonan, Korea
Tape	Scotch, Seoul, Korea	3M-810
Micro forceps	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	11253-27	Dumont #L5
Micro scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	15000-03	Vannas spring
Scissor	Fine Science Tools, Vancouver, Canada	14084-08	8.5 cm
Black silk suture	Ailee, Busan, Korea	SK6071, SK728	6-0 and 7-0
Reagents
meloxicam	Yuhan, Seoul, Korea
vet ointment	Novartis, Basel, Swiss
10% Povidone-iodine (betadine)	Firson, Cheon-an, Korea
FeCl3	Sigma, Missouri, United States	157740-5G
TTC	Amresco, Ohio, USA	0765-100g
Isoflurane	Hana-Pham, Gyeonggi, Korea	Ifran	100 mL
PBS	Welgene, Daegu, Korea	LB001-02	500 mL
Gold nanoparticles			Synthesis
C15 optical agent			Synthesis
Tissue plasminogen activator	Boehringer Ingelheim, Biberach, Germany	rtPA(actilyse)	20 mg
Normal saline	Daihan Pham, Seoul, Korea	48N3AF3	20 mL