Karakterisering av menneske moncyttavledede dendrittiske celler ved Imaging flowcytometrisystemer: En sammenligning mellom to Monocyte Isolation protokoller
Summary
This study compares two different methods of human monocyte isolation for obtaining in vitro dendritic cells (DCs). Monocytes are selected by adherence or negatively enriched by magnetic separation. Monocyte yield and viability along with MDDC viability, proliferation and CD11c/CD14 surface marker expression will be compared between both methods.
Abstract
Dendritic cells (DCs) are antigen presenting cells of the immune system that play a crucial role in lymphocyte responses, host defense mechanisms, and pathogenesis of inflammation. Isolation and study of DCs have been important in biological research because of their distinctive features. Although they are essential key mediators of the immune system, DCs are very rare in blood, accounting for approximately 0.1 – 1% of total blood mononuclear cells. Therefore, alternatives for isolation methods rely on the differentiation of DCs from monocytes isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The utilization of proper isolation techniques that combine simplicity, affordability, high purity, and high yield of cells is imperative to consider. In the current study, two distinct methods for the generation of DCs will be compared. Monocytes were selected by adherence or negatively enriched using magnetic separation procedure followed by differentiation into DCs with IL-4 and GM-CSF. Monocyte and MDDC viability, proliferation, and phenotype were assessed using viability dyes, MTT assay, and CD11c/ CD14 surface marker analysis by imaging flow cytometry. Although the magnetic separation method yielded a significant higher percentage of monocytes with higher proliferative capacity when compared to the adhesion method, the findings have demonstrated the ability of both techniques to simultaneously generate monocytes that are capable of proliferating and differentiating into viable CD11c+ MDDCs after seven days in culture. Both methods yielded > 70% CD11c+ MDDCs. Therefore, our results provide insights that contribute to the development of reliable methods for isolation and characterization of human DCs.
Introduction
Dendrittiske celler (DCS) er viktige formidlere av den medfødte og ervervede immunforsvar. De fungerer å indusere primære immunresponser og legge til rette for utvikling av immunologisk hukommelse. Disse cellene er primært ansvarlig for antigen capture, migrasjon og T-celle stimulering og blir derfor referert til som profesjonell antigen-presenterende celler (APC) en .Manipulation av DC kunne benyttes over et bredt spekter av forskningsfelt og i et klinisk miljø for å behandle forskjellig inflammatoriske sykdommer så som HIV 6,7, kreft, autoimmune sykdommer 8 til 9, og allergiske reaksjoner 10. DC blir også brukt for rusmisbruk forskning for å løse ukjente mekanismer og trasé for eksempel i forbindelse med alkoholavhengighet 11-14, narkotikaavhengighet 13,15, og kombinasjonen av HIV-infeksjon og rusmisbruk 16-19. Disse pågående studier og fremtidige forskningsstudier In innen immunologi gjøre in vitro generasjon DC svært viktig for forskningen. Det er imidlertid flere problemer forbundet med å isolere DC fra humant blod som de bare utgjør 0,1 til 1% av de totale mononukleære blodceller 20.
Til dags dato, noen av de veletablerte fremgangsmåter for generering av DC in vitro består av plast eller glass tilslutning av monocytter 21,22, tetthetsgradient-sentrifugering 23, spesifikk markør basert separasjon som for eksempel magnetisk aktivert cellesortering 22, fluorescerende aktivert cellesortering 24, positiv utvelgelse av CD14 + monocytter ved hjelp av dekstran-belagt magnetiske nanopartikler 25, og rask isolering av høyt rensede monocytter ved hjelp av helautomatisk negativ celleutvalget 26. Imidlertid er den beste metoden for valg er fortsatt kontroversielt. Derfor, for å forbedre DC generasjon teknikker, har flere metoder blitt utviklet i hvilkenrenhet av disse cellene kan bli sterkt øket ved differensiering fra rensede CD34 + forløperceller og monocytter ble isolert fra perifere mononukleære blodceller (PBMC) 27. Som nevnt tidligere, er en mye brukt og populær metode for å generere stammer fra monocytter dendrittiske celler (MDDCs) for å utforske muligheten for monocytter å følge glass eller plast (etterlevelse metode) 21,22,27. Den tilslutning Fremgangsmåten er en enkel og rask metode som ikke krever bruk av komplisert utstyr. Men noen ulemper ved denne fremgangsmåte omfatter lymfocytt forurensning, lav fleksibilitet, og monocytt forbigående manipulasjon 28. En alternativ fremgangsmåte til den tilslutning metode er den magnetiske isolering av monocytter fra total PBMC, særlig ved anvendelse av en human monocytt berikelse kit, som er konstruert for å isolere monocytter fra PBMC ved negativ seleksjon 26. I løpet av denne prosedyren, er uønskede celler rettet for fjernelse med tetramertantistoff-komplekser og dekstran-belagte magnetiske partikler. Fordelen med denne isolasjonsmetoden er at de uønskede merkede celler ble separert ved hjelp av en magnet mens målceller fritt kan helles ut i en ny slange, uten behov for kolonner. Til dags dato, med tilgjengeligheten av spesifikke monoklonale antistoffer som kan merke unike cellepopulasjoner, har den magnetiske separasjonsteknikk blir ikke bare en ytterligere metode, men en nødvendighet for isolering av sjeldne celler innen immunologi. For eksempel teknikker som magnetisk cellesortering med kommersielt tilgjengelige paramagnetiske MACS-nanopartikler har muliggjort utvikling av nye tilnærminger for forskning og kliniske applikasjoner 22,29. Videre har nyere studier som sammenligner DC generasjon fra monocytt etterlevelse og MACS teknologi metoder viste en høyere DC renhet og levedyktighet ved hjelp MACS atskilt monocytter 22,30.
Studien presentereren sammenligning mellom to fremgangsmåter for generering av humane DC fra monocytter ble isolert fra PBMC: 1) monocytt isolering ved tilslutning og 2) monocytt isolert ved negativ seleksjon ved anvendelse av et kommersielt human monocytt anrikning kit. Denne studien gir bevis for å vise at den negative utvalget magnetisk separasjon prosedyre for å isolere monocytter genererer høyest avkastning av monocytter med ingen signifikante forskjeller i monocytter levedyktighet sammenlignet med monocytter isolert ved etterlevelse metode. I sin tur, etter syv dager, monocytter isolert av magnetisk separasjon differensiert i MDDCs med betydelig høyere proliferativ kapasitet og høyere beløp av celler som uttrykker dobbelt positiv (CD11c + / CD14 +) fenotype uten å påvirke MDDC levedyktighet. Totalt sett er denne studien skiller seg fra de tidligere studier som det refereres til ovenfor, siden det viser evnen av begge teknikker for samtidig å generere monocytter som er i stand til prolifererende og differensiere til CD11c +MDDCs (> 70%) etter syv dager i kultur uten å svekke deres levedyktighet. I tillegg gir dagens tilnærming for første gang karakterisering av forskjellige CD11c / CD14 MDDCs populasjoner av bilde flowcytometri.
I sammendrag, siden DC spille en fokal rolle når det gjelder forskning innen immunologi, ulike parametere må tas i betraktning når man vurderer hvor de er avledet, og hvilke metoder som anvendes for å isolere og kultur dem in vitro. Derfor sikter denne studien å gi innsikt i to ulike metoder for monocytter isolasjon og hvordan disse metodene ulikt påvirker monocytt levedyktighet og utbytte til slutt påvirker dendrittiske cellen levedyktighet, spredning, og fenotype. Disse funnene vil bidra sterkt til feltet immunologi og vil gi en detaljert protokoll for DC isolering, rensing og karakterisering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basert på de kjente vanskelighetene med å isolere og generere MDDCs fra menneskeblod, denne studien forsøkte å gi en omfattende sammenligning av to veletablerte metoder for generering av MDDCs. Den første metoden sammen er et veletablert tradisjonell fremgangsmåte for å generere MDDCs ved å utnytte muligheten av monocytter til å følge glass eller plast (tilslutning metode) 21,22,27. Den tilslutning metoden er rask og kostnadseffektiv, og krever ikke bruk av komplisert utstyr. Men noen ulemper ved de…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research is supported by the National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, award K99/R00 AA021264. Additional lab support as part of startup package has been received from the Department of Immunology, Institute of NeuroImmune Pharmacology, Herbert Wertheim College of Medicine, and FIU- Office of Research and Economic Development. Gianna Casteleiro was supported by NIH/NIGMS R25 GM061347. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Ficoll-Paque | GE Healthcare | 17-5442-03 | Must be used at room temperature |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Life Technologies | 10010-023 | |
| ACK Lysing buffer | Quality Biological | 118-156-101 | |
| RPMI 1640 medium | Life Technologies | 22400-089 | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) | Life Technologies | 15240-062 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 16000-044 | |
| RoboSep buffer | StemCell | 20104 | |
| EasySep Human monocyte enrichment kit | StemCell | 19059 | |
| TC20 Automated cell counter | Bio-Rad | 145-0101 | |
| FITC-Dextran | Sigma Aldrich | FD4-100MG | |
| Trypan blue stain (0.4%) | Life Technologies | 15250-061 | |
| Synergy 2 multi-mode reader | Biotek | 7131000 | |
| XTT Sodium salt bioreagent (XTT) | Sigma Aldrich | X4626-100MG | |
| Dimethyl sulfoxide bioreagent (DMS) | Sigma Aldrich | D8418-500ML | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) | Sigma Aldrich | m5655-500MG | |
| Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Bio-Rad | 161-0302 | |
| Phenazine Methosulfate (DMSO) | Sigma Aldrich | P9626-1G | |
| Inactivated (HI) Human Serum | Chemicon | S1-100ML | |
| Accuri C6 Flow Cytometer | BD Accuri | 653119 | |
| FlowSight Amnis Flow Cytometer | EMD Millipore | 100300 |
Riferimenti
- Cella, M., Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Origin maturation and antigen presenting function of dendritic cells. Curr Opin Imunol. 9, 10-16 (1997).
- Banchereau, J., et al. Immunobiology of Dendritic Cells. Ann Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Kaouther, M., Ridha, O. Dendritic Cell-Based Graft Tolerance. ISRN Pharmacol. , (2011).
- Steinman, R., Gutchinov, B., Witmer, M., Nussenzweig, M. Dendritic cells are the principal stimulators of the primary mixed leukocyte reaction in mice. J Exp Med. 157, 613-627 (1983).
- Nair, M. N., et al. RNAi-directed inhibition of DC-SIGN by dendritic cells: Prospects for HIV-1 therapy. AAPS J. 7, E572-E578 (2005).
- Agudelo, M., et al. Chapter 10. Dendritic Cells: Types, Life Cycles and Biological Functions. , 167-177 (2010).
- Kajihara, M., Takakura, K., Ohkusa, T., Koido, S. The impact of dendritic cell-tumor fusion cells on cancer vaccines – past progress and future strategies. Immunotherapy. , (2015).
- Suwandi, J., Toes, R., Nikolic, T., Roep, B. Inducing tissue specific tolerance in autoimmune disease with tolerogenic dendritic cells. Clin Exp Rheumatol. 33, 0097-0103 (2015).
- Gorelik, M., Frischmeyer-Guerrerio, P. A. Innate and adaptive dendritic cell responses to immunotherapy. Curr Opin Allergy Immunol. 15, 575-580 (2015).
- Zwolak, A., et al. Peripheral blood dendritic cells in alcoholic and autoimmune liver disorders. Hum Exp Toxicol. 31, 438-446 (2012).
- Agudelo, M., et al. Differential expression and functional role of cannabinoid genes in alcohol users. Drug Alcohol Depend. 133, 789-793 (2013).
- Nair, M. P., Figueroa, G., Casteleiro, G., Muñoz, K., Agudelo, M. Alcohol Versus Cannabinoids: A Review of Their Opposite Neuro-Immunomodulatory Effects and Future Therapeutic Potentials. J Alcohol Drug Depend. 3, 184 (2015).
- Boukli, N. M., et al. Implications of ER Stress, the Unfolded Protein Response, and Pro- and Anti-Apoptotic Protein Fingerprints in Human Monocyte-Derived Dendritic Cells Treated With Alcohol. Alcohol Clin Exp Res. 34, 2081-2088 (2010).
- Nair, M. N., Mahajan, S., Sykes, D., Bapardekar, M., Reynolds, J. Methamphetamine Modulates DC-SIGN Expression by Mature Dendritic Cells. J Neuroimmune Pharmacol. 1, 296-304 (2006).
- Napuri, J., et al. Cocaine Enhances HIV-1 Infectivity in Monocyte Derived Dendritic Cells by Suppressing microRNA-155. PLoS ONE. 8, e83682 (2013).
- Nair, M. P. N., Saiyed, Z. M. Effect of methamphetamine on expression of HIV coreceptors and CC-chemokines by dendritic cells. Life Sciences. 88, 987-994 (2011).
- Nair, M. P. N., et al. Cocaine Modulates Dendritic Cell-Specific C Type Intercellular Adhesion Molecule-3-Grabbing Nonintegrin Expression by Dendritic Cells in HIV-1 Patients. J Immunol. 174, 6617-6626 (2005).
- Reynolds, J. L., Mahajan, S. D., Sykes, D. E., Schwartz, S. A., Nair, M. P. N. Proteomic analyses of methamphetamine (METH)-induced differential protein expression by immature dendritic cells (IDC). Biochem Biophys Acta. 1774, 433-442 (2007).
- Van Voorhis, W., Hair, L., Steinman, R., Kaplan, G. Human dendritic cells. Enrichment and characterization from peripheral blood. J Exp Med. 155, 1172-1187 (1982).
- Davis, G. The Mac-1 and p150,95 beta 2 integrins bind denatured proteins to mediate leukocyte cell-substrate adhesion. Exp Cell Res. 200, 242-252 (1992).
- Delirezh, N., Shojaeefar, E. Phenotypic and functional comparison between flask adherent and magnetic activated cell sorted monocytes derived dendritic cells. Iran J Immunol. 9, 98-108 (2012).
- Lehner, M., Holter, W. Endotoxin-Free Purification of Monocytes for Dendritic Cell Generation via Discontinuous Density Gradient Centrifugation Based on Diluted Ficoll-Paque Plus<sup>®</sup>. Int Arch Allergy Immunol. 128, 73-76 (2002).
- Van Brussel, I., et al. Fluorescent activated cell sorting: An effective approach to study dendritic cell subsets in human atherosclerotic plaques. J. Immunol Methods. 417, 76-85 (2015).
- Mucci, I., et al. The methodological approach for the generation of humandendritic cells from monocytes affects the maturation state of the resultant dendritic cells. Biologicals. 37, 288-296 (2009).
- Yuan, N., et al. . The American Association of Immunologists (AAI). , (2007).
- Romani, N., et al. Proliferating dendritic cell progenitors in human blood. J Exp Med. 180, 83-93 (1994).
- Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56, 236-240 (1994).
- Grützkau, A., Radbruch, A. Small but mighty: How the MACS®-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years. Cytometry Part A. 77A, 643-647 (2010).
- El-Sahrigy, S. A., Mohamed, N. A., Talkhan, H. A., Rahman, A. M. A. Comparison between magnetic activated cell sorted monocytes and monocyte adherence techniques for in vitro generation of immature dendritic cells: an Egyptian trial. Cent Eur J Immunol. 40, 18-24 (2015).
- Curry, C. V. . Differential Blood Count. , (2015).
- Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179, 1109-1118 (1994).
- Cavanagh, L. L., Saal, R. J., Grimmett, K. L., Thomas, R. Proliferation in Monocyte-Derived Dendritic Cell Cultures Is Caused by Progenitor Cells Capable of Myeloid Differentiation. Blood. 92, 1598-1607 (1998).
- Ardeshna, S. M., et al. Monocyte-derived dendritic cells do not proliferate and are not susceptible to retroviral transduction. Br J Haematol. 108, 817-824 (2000).
- Chapuis, F., et al. Differentiation of human dendritic cells from monocytes in vitro. Eur J Immunol. 27, 431-441 (1997).
- Zhou, L. J., Tedder, T. F. CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc Natl Acad Sci. 93, 2588-2592 (1996).
- Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180, 1841-1847 (1994).
- Caux, C., et al. Activation of human dendritic cells through CD40 cross-linking. J Exp Med. 180, 1263-1272 (1994).
- Fujii, S. i., Liu, K., Smith, C., Bonito, A. J., Steinman, R. M. The Linkage of Innate to Adaptive Immunity via Maturing Dendritic Cells In Vivo Requires CD40 Ligation in Addition to Antigen Presentation and CD80/86 Costimulation. J Exp Med. 199, 1607-1618 (2004).
- Mohammadi, A., Mehrzad, J., Mahmoudi, M., Schneider, M., Haghparast, A. Effect of culture and maturation on human monocyte-derived dendritic cell surface markers, necrosis and antigen binding. Biotech Histochem. 90, 445-452 (2015).
