ハイコンテンツ<em>インビトロ</em>膵島β細胞の複製ディスカバリー・プラットフォーム
Summary
糖尿病研究分野のための重要な課題は、膵島β細胞の複製を調節する分子機構を理解し、β細胞の再生を刺激するための方法を開発することです。本明細書中の小分子のβ細胞の複製を促進する活性を同定および評価するためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。
Abstract
Loss of insulin-producing β-cells is a central feature of diabetes. While a variety of potential replacement therapies are being explored, expansion of endogenous insulin-producing pancreatic islet β-cells remains an attractive strategy. β-cells have limited spontaneous regenerative activity; consequently, a crucial research effort is to develop a precise understanding of the molecular pathways that restrain β-cell growth and to identify drugs capable of overcoming these restraints. Herein an automated high-content image-based primary-cell screening method to identify β-cell replication-promoting small molecules is presented. Several, limitations of prior methodologies are surmounted. First, use of primary islet cells rather than an immortalized cell-line maximizes retention of in vivo growth restraints. Second, use of mixed-composition islet-cell cultures rather than a β-cell-line allows identification of both lineage-restricted and general growth stimulators. Third, the technique makes practical the use of primary islets, a limiting resource, through use of a 384-well format. Fourth, detrimental experimental variability associated with erratic islet culture quality is overcome through optimization of isolation, dispersion, plating and culture parameters. Fifth, the difficulties of accurately and consistently measuring the low basal replication rate of islet endocrine-cells are surmounted with optimized immunostaining parameters, automated data acquisition and data analysis; automation simultaneously enhances throughput and limits experimenter bias. Notable limitations of this assay are the use of dispersed islet cultures which disrupts islet architecture, the use of rodent rather than human islets and the inherent limitations of throughput and cost associated with the use of primary cells. Importantly, the strategy is easily adapted for human islet replication studies. This assay is well suited for investigating the mitogenic effect of substances on β-cells and the molecular mechanisms that regulate β-cell growth.
Introduction
糖尿病は、破壊されたグルコース恒常性の一般的なエンドポイントを共有する疾患のコレクションを含みます。糖尿病のサブタイプの病原性のメカニズムは異なっているが、それらは減少したβ細胞量、 すなわち 、インスリン産生能力1,2の損失の結果を共有します。現在、糖尿病の治療戦略は、外因性インスリン、インスリン感受性のインスリン産生または増強の薬理学的刺激、およびまれに、膵島または膵臓全体3,4の移植の慢性投与に依存しています。残念ながら、これらの戦略の成功は短命であり、および/または十分に内因性インスリン産生の機能を再現することができません。 β細胞の再生を刺激するための方法の開発の有用性にもかかわらず、そのような手法は存在しません。したがって、主要な糖尿病の研究の目標は、新しいβ細胞を生成するために、または内因性β細胞量5を展開するための方法を開発することです</sup>。このような胚性幹細胞などの再生可能エネルギー源からのβ細胞の再生が進んでいるが、安全性と効率性の懸念は、成熟β細胞の拡大、優先度6,7を含む代替戦略の追求を行います。重要なことには、in vivoでの新β細胞の主な供給源は、既存のβ細胞ではなく、特殊な前駆細胞8,9です。 β細胞は、制限された複製能力を有するように見えるが、β細胞量（〜30％）のわずかな増加は、多くの糖尿病患者のグルコースホメオスタシスを回復するのに十分であり得ます。また、β細胞量のその場の薬理学的刺激に潜在的に安価でスケーラブルな治療戦略です。本明細書中でβ細胞の増殖を刺激する小分子を同定し、特徴づけるためのハイコンテントスクリーニング方法が提供されます。
インビトロ実験方法の様々な遺伝子産物および/ または分子THAを同定することができますトンの一次β細胞の複製を促進します。 β細胞複製の誘導を測定するための初期の努力は、特定の処理条件10に対応してアルデヒドチオニンまたはインスリン染色された集団内の[3 H]チミジン取り込み、BrdU取り込みや有糸分裂体を測定するために胎児げっ歯類膵臓培養または無傷の単離された膵島培養を使用しました11。これらのin vitroでのアプローチと密接な変異体は、それらのいくつかの制限があります。著名な欠陥が成熟β細胞とは異なり、高い基礎β細胞の複製速度を表示し、明確な方法12で調節成長している、胎児細胞の（1）の使用が含まれます。 （2）β細胞の複製イベントの実験に依存する裁定の主観的な性質; （3）β細胞の複製イベントの実験に依存カウントの労力と時間集約的な性質は、実験的なスループットを遅らせます。 （4）核取り込み/染色/外観を使用することはあっても、複製を識別するためにTSおよびβ細胞を同定するための非重複細胞質染色はβ細胞に近接する非β細胞複製イベントの誤帰属につながります。
より最近では、成熟一次β細胞は、β細胞の複製13-16の過剰発現導入遺伝子の影響だけでなく、遺伝子産物または化合物の治療を評価するために使用されてきました。しかし、これらの研究はまた、複製イベント、β細胞の同定および/ またはスループットを制限する労働集約型の手順、 例えば 、細胞または無傷の膵島の個々のスライドウェルめっきの細胞質staining-または非特異的な方法の主観的なカウントに依存していますパラフィン包埋し、処理17。なお、本明細書に提示1に似たイメージベースのヒトβ細胞複製のスクリーニング方法は、18を公開されています。しかしながら、このアッセイの使用の成功が実証されておらず、一次スクリーニングのためのヒト膵島の使用が広くFEAではないかもしれませんsible。
複製促進物質を同定するための代替戦略は、β細胞株の増殖の誘導を評価することです。初期の努力は、MIN6細胞またはINS 13分の832細胞14,19-21形質転換β-細胞株を使用していました。しかし、これらの細胞株は、気ままな成長を示し、高分化型β細胞22に少し似ていません。したがって、成長誘導能力は、最小限の不明確関連性と再現することが困難な場合があります。細胞株ベースのスクリーニングのための改良された戦略は、テトラサイクリン（ドキシサイクリン）の非存在下での増殖停止依存SV40のT抗原の発現23,24ある細胞を「可逆的に形質転換された」利用します。しかし、これらの細胞はドキシサイクリンの除去の際に「正常な」β細胞様の状態に戻すかどうかは不明です。残念ながら、これらの細胞の使用は、即時の有用性を有するとは思われない一般的な成長促進化合物をもたらしました24。全体的に、最小限の自発的複製活性を示す細胞型の成長調節を研究するための細胞系の使用が制限された適用性を有していてもよいです。
本明細書に提示β細胞複製スクリーニングプラットフォームは、マルチ、成熟した初代ラットβ細胞は、系統制限成長促進活動の識別を可能にするために、可能な限り生体内増殖調節、混合細胞型組成物の膵島細胞培養で保持することを利用しますバイアスを排除し、スループットを容易にするために、スループットと自動分析を最大化するために、書式設定型ウェル。このプラットフォームの使用の成功は、β細胞の複製25,26を促進するいくつかの化合物の同定を可能にしました。さらに、アッセイは、β細胞の複製の分子調節に機構的洞察を提供するために、構造活性相関研究および化学エピスタシス実験に使用されてきました。提示プラットフォームが正常にfoが適応されましたRβ細胞複製のレンチウイルスのRNAiベースの調査は25の経路。アッセイの制限事項は、（一次細胞の使用）スケーラビリティを制限含まれ、むしろ抗体ベースのイメージングおよび一次膵島の使用、使用に関連した（アッセイは、ヒト膵島研究のために適合させることができるけれども）は、ヒト膵島細胞、費用よりもげっ歯類の使用画像収集および分析機能を備えた自動顕微鏡の利用時に自動化された画像の取得と依存性を容易にするために、分散した島（破壊された膵島アーキテクチャ）の。遺伝子産物またはその場での β細胞の再生を刺激する化合物を同定するための容易なin vivoでのスクリーニング方法が理想的であろうが、このようなプラットフォームは、まだ27利用できません。したがって、記載プラットフォームはβ細胞複製のほとんどの側面を調査することに興味の研究者に適しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
β細胞の成長と再生を制御する分子経路を研究するための実験方法は、糖尿病の研究者のための重要なツールです。ここで、β細胞複製の小分子の刺激を同定および特徴付けるラット膵島ベースのスクリーニングプラットフォームが提供されます。
このプロトコルのほとんどの側面を容易に経験豊富な研究者によって行われているが、いくつかの手順は、特定の技術を必…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIDDK grants DK098143 and DK101530 from the NIH (JPA), Stanford’s Spectrum Child Health Research Institute (CHRI) and SPARK (UL1 TR001085, JPA).
Materials
| 250g male Male Sprague Dawly Rat | Charles River | Stain # 400 | |
| 12 cm teeth tisuue forceps | Fine Science Tools | 11021-12 | |
| 11.5 cm fine scissors | Fine Science Tools | 14058-11 | |
| 14.5 cm surgical scissors | Fine Science Tools | 14001-14 | |
| 16 cm curved forceps | Fine Science Tools | 11003-16 | |
| 12 cm curved hepostat | Fine Science Tools | 13011-12 | |
| 12 cm scalpel handle | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Tissue sieve-30 mesh | Bellco Glass | 1985-85000 | |
| Cizyme RI, 375,000 CDA units | VitaCyte | 005-1030 | |
| Hanks' Balanced Salt solution (Ca++ and Mg++) | Gibco | 24020-117 | |
| Ketamine HCl (200 mg/20 ml) | JHP Pharmaceuticals | NDC# 42023-113-10 | to make anesthetic cocktail |
| Xylazine (5 g/50 ml) | LLOYD | NADA# 139-236 | to make anesthetic cocktail |
| Histopaque 1077 | Sigma | H-1077 | to make histopaque 1100 |
| Histopaque 1119 | Sigma | H-1119 | to make histopaque 1100 |
| Newborn Calf Serum 500 ml | Hyclone | SH30118.03 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Hyclone | SH30268.01 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Low Glucose | Hyclone | SH30021.01 | |
| Functionality/Viability Solution | Mediatech | 99-768-CV | |
| RPMI1640 media | Hyclone | SH30096.01 | to make conditioned medium |
| 804G rat bladder carcinoma cell-line | Available upon request | to make conditioned medium | |
| Fetal Bovine Serum, Qualified | Gibco | 26160 | |
| GlutaMax-I | Gibco | 35050-061 | |
| Penicillin (5,000 IU/ml/Strptomycin (5 mg/ml) | MP Biomedicals | 1670049 | |
| Formamide 500 mL | Fisher BioReagents | BP227-500 | |
| Antigen Unmasking Solution 250 mL (PH 6.0) | Vector Laboratories | H-3300 | to make 0.15 M Sodium Sitrate solution |
| Dextrose, Anhydrous | EMD Chemicals | DX0145-1 | to make 1 M glucose solution |
| Nomal Donkey Serum (Powder) | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787-100ML | |
| Mouse anti-human Ki67 antibody | BD Biosciences | 556003 | |
| Goat anti-human PDX-1 antibody | R&D Systems | AF2419 | |
| Polyclonal Guinea Pig anti-insulin antibody | Dako | 2016-08 | |
| Polyclonal Rabbit anti-glucagon antibody | Dako | 2014-06 | |
| Polyclonal Rabbit anti-somatostatin antibody | Dako | 2011-08 | |
| Polyclonal chicken anti-vimentin antibody | abcam | ab24525 | |
| Biotin-SP-conjugated, Donkey Anti-Mouse IgG | Jackson ImmunoResearch | 715-065-150 | |
| StreptAvidin, Alex Flour 488 conjugated | Invitrogen | S32354 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-025-147 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-025-148 | |
| Rhodamine-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-025-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Guinea Pig IgG | Jackson ImmunoResearch | 706-175-148 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Goat IgG | Jackson ImmunoResearch | 705-175-147 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Rabbit IgG | Jackson ImmunoResearch | 711-175-152 | |
| Cy 5-conjugated Donkey Anti-Chicken IgG | Jackson ImmunoResearch | 703-175-155 | |
| DAPI | Millipore | S7113 | |
| Disposable Reagent Reservoir 25 mL | Sorenson BioScience | 39900 | |
| 384 well, black/clear, tissue culture treated plate | BD Falcon | 353962 | |
| 96 well, black/clear, tissue culture treated plate | Costar | 3603 | |
| Multi-channel pipettor | Costar | 4880 | |
| 12-channel vaccume aspirator | Drummond | 3-000-096 | |
| Cell Scraper | Falcon | 353085 | |
| Isotemp Water Bath Model 2223 | Fisher Scientific | ||
| High-content screening instrument: ArrayScan VTI | Thermo Scientific |
Riferimenti
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