Kirurgisk tilnærming for Middle Cerebral arterien okklusjon og reperfusjon Induced Stroke i Mus

Summary

For å forstå patofysiologien for slag, er det viktig å benytte pålitelige modeller. Denne oppgaven vil beskrive en av de mest brukte slag modeller i mus, betegnet tilstopping av midtre cerebralarterie (MCAO) modell (også kalt den intraluminale filament sutur eller modell) med reperfusjon.

Abstract

Hjerneslag er en ledende dødsårsaken i verden og fortsetter å være en av de viktigste årsakene til langtids voksne funksjonshemninger. Om 87% av slag er iskemisk opprinnelse og forekommer i territoriet til midten cerebral arterie (MCA). I dag den eneste Food and Drug Administration (FDA) godkjente legemiddelet for behandling av denne ødeleggende sykdommen er vevsplasminogenaktivator (tPA). Imidlertid har tPA en liten terapeutisk vindu for administrasjon (3-6 timer), og er bare effektiv i 4% av pasientene som faktisk får det. Dagens forskning fokuserer på å forstå patofysiologien av slag for å finne potensielle terapeutiske mål. Dermed pålitelige modeller er avgjørende, og MCA okklusjon (MCAO) modell (også kalt intraluminal filament eller sutur modell) anses for å være den mest klinisk relevant kirurgisk modell for iskemisk slag, og er ganske ikke-invasiv og lett reproduserbar. Typisk MCAO-modellen brukes sammen med gnagere, spesielt med mus grunntil alle de genetiske varianter tilgjengelig for denne arten. Her beskriver vi (og til stede i videoen) hvordan du lykkes utføre MCAO modellen (med reperfusjon) i mus for å generere pålitelige og reproduserbare data.

Introduction

Hjerneslag er den femte største dødsårsaken i verden, med en person dør av sykdommen hvert 4. minutt. Over 800.000 amerikanere lider et hjerneslag hvert år, noe som ikke bare ødeleggende for pasienten, men også for deres familier. Hjerneslag er den viktigste årsaken til uførhet og den årlige utgifter er anslått til å være i størrelsesorden $ 36500000000 ¹ til tross for svært få behandlingstilbud blir tilgjengelige.

Vevsplasminogenaktivator (tPA) er den eneste Food and Drug Administration (FDA) lisensiert narkotika for hjerneinfarkt. Det er imidlertid bare effektivt dersom administrert til pasienter i løpet av 3-6 timer fra starten av slaget, og i slike tilfeller den fordeler bare 4% av pasientene ^2. Derfor er det viktig at reproduserbare, klinisk relevante dyremodeller for slag brukes for å hjelpe til i utviklingen av potensielle terapeutiske strategier og behandlingene for denne sykdommen. Det er viktig å merke seg at in vitro </em> modeller, mens nyttig i modellering visse aspekter av cerebral dysfunksjon, er ikke i stand til recapitulating de komplekse fysiologiske interaksjoner som oppstår i hjernen og periferien etter et slag. Følgelig in vivo-modeller er avgjørende.

Den vanligste typen av hjerneslag er iskemisk opprinnelse, sto for 87% av totalt antall slag. Andre slag er intracerebral blødning (9%) og subaraknoid blødning (4%), og skyldes som oftest av en emboli til den midtre cerebrale arterie (MCA). Dette skyldes den fremtredende kurve ved roten av MCA, noe som fører til laminær blodstrømmen inn i hjernen til å bli forstyrret. MCA oppstår fra arteria carotis interna (ICA) og ruter langs side sulcus, der det grener og prosjekter til basalgangliene og sideflatene av frontal, parietal og tinninglappene, inkludert den primære motoriske og sensoriske cortex. The Circle of Willis er skapt av posteriore cerebrale arterier blirkoblet til cerebrale arterier og de bakre kommunisere arteriene.

Den intraluminale filament sutur eller modell av MCAO er en av de mest utbredt i strøk forskning. Det finnes imidlertid et par forskjellige variasjoner av denne modellen, og disse er basert på hvorvidt den fila settes inn i den ytre halsarterie (ECA, betegnet Longa metoden) ^3, eller om det er satt inn i ICA (betegnet Koizumi metode) ^4. I Koizumi metode, må den felles halsarterie (CCA) på siden av operasjonen blir permanent bundet dersom filamentet er fjernet for å forhindre blødning fra innsnitt i CCA, mens i Longa metode er det ECA som skal være permanent bundet ⁵ . Her Longa metoden vil bli brukt som vi føler at dette er en langt bedre og mer klinisk relevant kirurgisk modell av hjerneinfarkt. Videre er anvendelse av en silisium spiss monofilament, spesielt med Longa fremgangsmåten, produserer megetreproduserbar MCAO i motsetning til de flamme avstumpet monofilamenter, som ofte gir ufullstendig okklusjon og / eller subaraknoidalblødning ^6.

Den intraluminale filament-metoden kan brukes som en modell for permanent eller forbigående okklusjon ^4,6. For å utføre transient-modellen, blir filamentet fjernet etter en periode med ischemi (f.eks, 30 min, 60 min, eller 2 timer), og reperfusjon tillates å skje. Denne modellen, til en viss grad, simulerer den gjenopprettelse av blodstrøm etter spontan eller terapeutisk intervensjon (for eksempel, tPA administrering) til å lysere en tromboembolisk blodpropp i mennesker. For permanent modell, blir filamentet bare igjen på plass for en tidsperiode (for eksempel 24 timer), slik at ingen reperfusjon inntreffer. En annen fordel ved intraluminal filament-metoden er det faktum at en kraniotomi ikke trenger å bli utført, slik at hodeskallen til å være intakt og å unngå eventuelle endringer i intrakranielt trykk og temperatur.

<p class = "jove_content"> I denne videoen viser vi hvordan du utfører Longa intraluminal filament metode for å indusere MCAO og reperfusjon. Vi viser også hvordan du utfører den 18-punkts nevrologisk score og avgjøre infarktvolum ved hjelp av 2,3,5-triphenyltetrazalium klorid (TTC) farging.

Protocol

Denne protokollen og forsøkene rapportert i videoen ble godkjent av LSUHSC-S Institutional Animal Care og bruk Committee og er i samsvar med retningslinjene fra NIH. MERK: Mann C57BL / 6-mus som veide 25-29 g, ble anvendt i denne studien. Musene ble opprettholdt på et standard chow pellet kosthold med fri tilgang til vann, under en 12 timers lys / mørke syklus individuelt ventilerte bur. Prosedyren vil bli utført under sterile forhold ved hjelp av sterile teknikker (f.eks, sterile hansker, sterile instrumenter). <p …

Representative Results

Mus som gjennomgikk 30-min MCAO-indusert hjerne ischemi (figur 1), etterfulgt av en periode med reperfusjon (24 hr, og en wk er presentert her, men lengden av reperfusjon kan varieres). Den dødelighet under MCAO var minimal (ca. 2%). Post iskemi, dødeligheten (innen de første 24 timer) var rundt 26%. Laser Doppler-strømningsmåling ble benyttet for å bekrefte blodstrøm perfusjon i MCA område før og ett…

Discussion

Siden unnfangelsen 20 år siden, har MCAO modell for menneskelig slag som involverer innsetting av et filament blitt brukt i et stort antall studier. Dette er hovedsakelig på grunn av det faktum at det etterligner det som skjer klinisk i den mest vanlige form for slag (dvs., iskemisk slag). Striatum er mer følsom overfor ischemi enn hjernebarken, og som sådan vil lengden av ischemisk tid slår ut om både striatum og dorsolateral cortex vil bli påvirket, eller bare striatum. Begge infarkt og reperfusjon gan…

Materials

Male C57BL/6 mice	Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME	#000664
Ketamine Hydrochloride	Morris & Dickson, Shreveport, LA	67457-108-10
Xylazine	Akorn, Inc, Lake Forest, IL	NADA# 139-236
DC temperature control system	FHC, Bowdoin, ME	40-90-8D
Mini rectal thermistor probe	FHC, Bowdoin, ME	40-80-5D-02
Heating pad	FHC, Bowdoin, ME	40-90-2-06
Clippers	Amazon, Bellevue, WA	#64800
70% ethanol	Worldwide Medical Products, Bristol, PA	#51011023
Dissecting microscope	Olympus, Center Valley, PA	SZ40
Iris scissors (straight)	Fine Science Tools, Foster City, CA	11251-20
Dumont forceps (45° bent tip)	Fine Science Tools, Foster City, CA	11297-00
Micro vessel clip	Fine Science Tools, Foster City, CA	18055-05
Micro dissecting spring scissors (straight)	Fine Science Tools, Foster City, CA	14088-10
Retractors (blunt)	Fine Science Tools, Foster City, CA	18200-11 (Helen used 17022-13)
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific, Waltham, MA	23-400-100
Gauze sponges	Covidien, Mansfield, MA	#9023
6-0 silk braided surgical suture	Roboz, Gaithersburg, MD	SUT-1073-11
0.9% sodium chloride	Morris & Dickson, Lake Forest, IL	0409-4888-20
6-0 medium MCAO suture (silicon rubber coated monofilament)	Doccol Corporation, Sharon, MA	6023PKRe
Sofsilk 6-0 silicone coated braided silk	Covidien, Mansfield, MA	SUT-14-1
Carprofen	Pfizer, New York, NY	NADA# 141-199
Puralube	Dechra, Norwich, UK	NDC 17033-211-38
Physitemp temperature controller	Harvard Apparatus, Holliston, MA	TCAT-2AC
Heat lamp	Harvard Apparatus, Holliston, MA	HL-1
Laser doppler probe	AD Instruments, Colorado Springs, CO	MSP100XP
24-well plates	Fisher Scientific, Waltham, MA	#353226
Phosphate buffered saline (PBS)	Life Technologies, Carlsbad, CA	20012-050
Single edge razor blades	Fisher Scientific, Waltham, MA	12-640
2,3,5-triphenyltetrazalium chloride (TTC)	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	T8877-50G
Mouse brain matrix slicer	Braintree Scientific, Braintree, MA	BS-A 5000C
Water bath	VWR, Radnor, PA	#182
10% formalin	Sigma Aldrich, St. Louis, MO	HT501128-4L
Image J analysis software	NIH, Bethesda, MD	free download
Retractor	Medical Device Purchase, Newcastle, CA	MP-740