Korrelative Light- und Elektronenmikroskopie Quantum Dot Nanopartikel
Summary
A method is described whereby quantum dot (QD) nanoparticles can be used for correlative immunocytochemical studies of epoxy embedded human pathology tissue. We employ commercial antibody fragment conjugated QDs that are visualized by widefield fluorescence light microscopy and transmission electron microscopy.
Abstract
Es wird ein Verfahren beschrieben, wobei Quantenpunkt (QD) Nanopartikel können für die korrelative immunzytochemische Studien der menschlichen Pathologie Gewebe unter Verwendung von Weitfeldfluoreszenzlichtmikroskopie und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM) verwendet werden. Um zu demonstrieren, das Protokoll haben wir ultradünnem epoxy Abschnitte des menschlichen Somatostatinom Tumor immunmarkierten einen primären Antikörper gegen Somatostatin verwendet, gefolgt von einem biotinylierten sekundären Antikörper und Sichtbarmachung mit Streptavidin konjugiert ist 585 nm Cadmium-Selen (CdSe) Quantenpunkte (QD). Die Abschnitte werden auf einem TEM Objektgitter montiert dann durch Mikroskopie Weitfeld- Fluoreszenzlicht auf einen Glasträger zur Beobachtung angeordnet. Die Lichtmikroskopie zeigt 585 nm QD Kennzeichnung als leuchtend orange Fluoreszenz ein körniges Muster innerhalb der Tumorzelle Zytoplasma bilden. Bei niedrigen bis mittleren Bereich Vergrößerung durch Lichtmikroskopie die Markierungsmuster leicht erkannt werden kann, und die Höhe der nicht-spezifische oder Hintergrundmarkierung bewertet. Dies ist ein kritischerSchritt für die anschließende Interpretation der Immunomarkierung Musters durch TEM und Bewertung des morphologischen Kontext. Der gleiche Abschnitt wird dann trocken getupft und mit TEM betrachtet. QD Sonden gesehen in einzelnen sekretorischen Granula enthalten amorphes Material angebracht werden. Die Bilder werden aus der gleichen Region von Interesse (ROI) gesehen durch Lichtmikroskopie für die korrelative Analyse erworben. können Bilder von jeder Modalität entspricht, dann vermischt werden Fluoreszenzdaten auf TEM Ultrastruktur des entsprechenden Bereichs zu überlagern.
Introduction
Korrelative Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) ist ein leistungsfähiges Verfahren für die Analyse von transienten dynamischen Ereignissen 1, seltene Ereignisse 2, 3 und komplexe Systeme 4. Es gibt viele verschiedene technische Permutationen verfügbar 5 je nach Fragestellung jedoch aufgefordert, eine häufige Anforderung ist , dass die gleiche Struktur in einer einzigen Probe 6 durch mehrere Mikroskopie Modalitäten abgebildet wird. Unsere besondere Herangehensweise an Clem wurde für das Studium der Archiv menschlichen Pathologie Gewebe und den Fall entwickelt hier verwendet wurde , gut charakterisiert und bisher 7 veröffentlicht. Ziel war es zunächst, die analytischen Daten aus einer einzigen Biopsie oder chirurgische Probe und zum anderen zu maximieren, Fluoreszenzlichtmikroskopie verwenden, um den Kontext des immunzytochemischer Markierungsmuster auf ultrastruktureller Ebene gesehen zu helfen, zu klären.
Quantenpunkt-Nanokristalle (QD) bieten das Potenzial eines universellen Markersystem able von beiden betrachtet werden, Fluoreszenzlichtmikroskopie und Elektronenmikroskopie 8, 9, 10. ihrer kristallinen Kernstruktur ermöglicht QD unterschiedlicher Größe eine Vielzahl von Fluoreszenzemissionsspitzen zu erzeugen , wenn 11 durch Licht bei Wellenlängen weit von ihren Emissionsspektren angeregt. Deren Atomgewicht reicht Elektronendichte zu ergeben, die durch Transmissionselektronenmikroskopie, Rastertransmissions-Elektronenmikroskopie (STEM) oder Feldemissionsrasterelektronenmikroskopie detektierbar ist. Sie eignen sich besonders für immunzytochemische Studien geeignet , da auch einzelne QDs beobachtet werden kann eine ultimative Empfindlichkeit eines QD pro Ziel geben Molekül 12. Weiterhin verwendet auf der QD je können sie eine einzelne Elementar Signatur geeignet für die Zuordnung besitzen.
Menschliche Pathologie Proben bieten erhebliche Vorteile für die translationale biomedizinische Forschung. Chirurgische Gewebe und Biopsieproben werden routinemäßig für Biobanken vorgelegt und mit geeignet friate Ethik Abstände können für Forschungsstudien zugegriffen werden. Menschliches Gewebe nicht über Fragen von Bedeutung oder Interpretation , die in tierischen oder in vitro – Modellen der Krankheit auftreten können. Jedoch die Probenvorbereitung der Pathologie Proben oft nicht optimal ist. Es kann in Fixiermittel verwendet unangemessen Verzögerung im Gewebe platziert Fixiermittel wie Formalin statt Glutaraldehyd für TEM und unangemessene Probenahme. Clem Methoden haben das Potenzial, die diagnostische und prognostische Informationen aus einer einzigen menschlichen Probe zu optimieren. Allerdings sind einige neu entwickelte Korrelat Ansätze , wie sie unter Verwendung von Mini – Singlet Sauerstoff – Generator (miniSOG) für den Einsatz in der Pathologie nicht verfügbar , da die Notwendigkeit für das Tag genetisch in die Zelle von Interesse 13 codiert werden. Aus diesem Grund haben wir die Nützlichkeit von QD Kennzeichnung von routinemäßig vorbereitet TEM Gewebe für die korrelative immunzytochemische Studien untersucht. QP angewandt geätzten Epoxid- oder Acrylharz-Abschnitte von lightly Aldehyd fixiert Biopsie und Gewebeproben bieten die Möglichkeit, Korrelat Fluoreszenzlichtmikroskopie und TEM-Daten aus einer einzigen Probe zu erhalten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diese Studie hat das Potenzial, Nutzen von QD als universelle Sonden für CLEM Studien nachgewiesen. Die 585 nm QD verwendeten Nanopartikel zeigten helle und stabile Fluoreszenz, wenn sie durch Weitfeld- Lichtmikroskopie betrachtet und wurden durch TEM leicht beobachtet. Eine frühere Studie von einem der Autoren dieses hat auch QD gezeigt für superauflösende Lichtmikroskopie 7 geeignet zu sein. Ihre Photo war besonders nützlich für längere Betrachtungszeiten und lange Abbildungs Belichtungen. QD k…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors wish to acknowledge the support of Xiao Juan Wu (Immunohistochemistry Laboratory) and the Department of Anatomical Pathology, Sydney South West Pathology Service (SSWPS), NSW Health Pathology, Liverpool, New South Wales, Australia.
Materials
| Sodium cacodylate | Proscitech | C0205 | Harmful chemical |
| Osmium tetroxide | Proscitech | C010 | Use only in fume hood |
| Uranyl acetate | Univar-Ajax | 569 | Hazardous chemical |
| Ethanol 100% | Fronine | JJ008 | |
| Acetone 100% | Fronine | JJ006 | |
| ERL 4221 | Proscitech | C056 | |
| DER 732 | Proscitech | C047 | |
| NSA | Proscitech | C059 | |
| DMAE | Proscitech | C050 | |
| Sodium metaperiodate | Analar BDH | 10259 | |
| anti-somatostatin antibody | Dako | A0566 | |
| Antibody diluent | Dako | S3022 | |
| Qdot 585 Streptavidin Conjugate | Invitrogen | Q10113MP | |
| Biotinylated goat anti-rabbit IgG antibody | Sigma | B7389-1ML | |
| Glutaraldehyde 50% | EMS | 16320 | |
| Normal goat serum | Invitrogen | PCN5000 | |
| PBS "Dulbecco A" | Oxoid | BR0014G | |
| BSAc (10%) | Aurion | 900.022 | |
| Parafilm | Pechiney PP | M | |
| pH indicator strips (pH 2.0 – 9.0) | Merck | 1.09584.0001 | |
| Micromoulds | Proscitech | RL063 | |
| Diamond knife | Diatome | Ultra 45 | |
| Transmission electron microscope | FEI | Morgagni 268D | |
| Fluorescence light microscope | Carl Zeiss | Axioscope A1 | |
| Grids 300 mesh nickel (thin bar) | Agar Scientific | G2740N | |
| Ultramicrotome | RMC | Powertome | |
| TEM camera control software | Soft Imaging System | AnalySIS | Version 3.0 |
| Image processing software | Adobe Systems Incorporated | Photoshop CS2 |
Riferimenti
- Kukulski, W., Schorb, M., Welsch, S., Picco, A., Kaksonen, M., Briggs, J. A. Correlated fluorescence and 3D electron microscopy with high sensitivity and spatial precision. J Cell Biol. 192 (1), 111-119 (2011).
- Müller-Reichert, T., Verkade, P. Introduction to correlative light and electron microscopy. Methods Cell Biol. , (2012).
- De Boer, P., Hoogenboom, J. P., Giepmans, B. N. Correlated light and electron microscopy: ultrastructure lights up!. Nat Methods. 12 (6), 503-513 (2015).
- Faas, F. G., et al. Localization of fluorescently labeled structures in frozen-hydrated samples using integrated light electron microscopy. J Struct Biol. 181 (3), 283-290 (2013).
- Redemann, S., Müller-Reichert, T. Correlative light and electron microscopy for the analysis of cell division. J Microsc. 251 (2), 109-112 (2013).
- Spiegelhalter, C., et al. From dynamic live cell imaging to 3D ultrastructure: novel integrated methods for high pressure freezing and correlative light-electron microscopy. PLoS One. 5 (2), e9014 (2010).
- Killingsworth, M. C., Lai, K., Wu, X., Yong, J. L., Lee, C. S. Quantum dot immunocytochemical localization of somatostatin in somatostatinoma by widefield epifluorescence, super-resolution light, and immunoelectron microscopy. J Histochem Cytochem. 60 (11), 832-843 (2012).
- Nisman, R., Dellaire, G., Ren, Y., Li, R., Bazett-Jones, D. P. Application of quantum dots as probes for correlative fluorescence, conventional, and energy-filtered transmission electron microscopy. J Histochem Cytochem. 52 (1), 13-18 (2004).
- Giepmans, B. N., Deerinck, T. J., Smarr, B. L., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Correlated light and electron microscopic imaging of multiple endogenous proteins using quantum dots. Nat Methods. 2 (10), 743-749 (2005).
- Kuipers, J., de Boer, P., Giepmans, B. N. Scanning EM of non-heavy metal stained biosamples: Large-field of view, high contrast and highly efficient immunolabeling. Exp Cell Res. 337 (2), 202-207 (2015).
- Barroso, M. M. Quantum dots in cell biology. J Histochem Cytochem. 59 (3), 237-251 (2011).
- Michalet, X., et al. Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science. 5, 538-544 (2005).
- Shu, X., et al. A genetically encoded tag for correlated light and electron microscopy of intact cells, tissues and organisms. PLoS Biol. 9 (4), e1001041 (2011).
- Thomas, J. M., Midgley, P. A. High-resolution transmission electron microscopy: the ultimate nanoanalytical technique. Chem Commun. , 1253-1267 (2004).
- Loussert Fonta, C., Humbel, B. M. Correlative microscopy. Arch Biochem Biophys. 581, 98-110 (2015).
- Marc, R. E., Liu, W. Fundamental GABAergic amacrine cell circuitries in the retina: nested feedback, concatenated inhibition, and axosomatic synapses. J Comp Neurol. 425 (4), 560-582 (2000).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- Tokuyasu, K. T. Immunochemistry on ultrathin frozen sections. Histochem J. 12 (4), 381-403 (1980).
- Loussert Fonta, C., et al. Analysis of acute brain slices by electron microscopy: a correlative light-electron microscopy workflow based on Tokuyasu cryo-sectioning. J Struct Biol. 189 (1), 53-61 (2015).
