Konventionelle metoder til at initiere suspension aggregat baseret hjertedifferentiering af humane pluripotente stængler celler (hPSCs) er plaget med kultur heterogenitet med hensyn til den samlede størrelse og form. Her beskriver vi en robust metode til hjertedifferentiering anvender mikrobrønde at generere størrelse-kontrollerede hPSC aggregater dyrkes under hjerte–fremmende betingelser.
Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.
In vitro-cellekultur kan udføres under en række modaliteter, men udføres typisk enten i todimensionale adhærerende forhold eller i tredimensionelle suspension betingelser, der mere fuldstændigt rekapitule- in vivo-systemer. Derfor er der en stigende tendens i mange områder af forskning for at udvikle robuste metoder til at generere tredimensionelle væv konstruktioner. I scenarier, hvor celletyper og processer kræver en støttende ekstracellulære matrix (ECM) overfladeaktive og vedhæftning signaler, kan tre-dimensionelle kultur aktiveres via afstivet konstruktioner, hvor cellerne dyrkes på eller i en eksogen støtte matrix 1. Celler og processer, der ikke kræver vedhæftning til en støttende matrix kan udføres i suspension som unscaffolded systemer bestående primært eller udelukkende af celler (som så kan fortsætte at generere deres egne endogene matricer) 2,3. Her præsenterer vi en protokol for hjerte-differentiering of menneskelige pluripotente stamceller (hPSCs – stamceller i stand til at blive hvilken som helst celletype i kroppen, hvad enten fra embryonale eller andre kilder) i størrelse-kontrolleret, ensartet, unscaffolded aggregater.
Differentiering af hPSCs som suspension aggregater er plaget af store variationer i den samlede størrelse både i en køre og mellem kørsler. Denne variabilitet er en konsekvens af den metode, der typisk anvendes til at generere disse aggregater, der involverer mekanisk dissociation af cellekolonier. For at reducere denne variabilitet, har en række metoder blevet anvendt til at kontrollere antallet af celler pr aggregat samt aggregatdiameter og ensartethed. Eksempler indbefatter dannelse af aggregater i mikrocentrifugerør 4 eller som hængende dråber 5, micropatterning defineret todimensionale hPSC kolonier 6, som derefter kan overføres til suspension eller centrifugering af celler i U- eller V-bundede flerbrøndsplader 7,8, 9. Men alle disse ca.oaches er begrænset af deres lille produktion af den samlede produktion. Well-baserede systemer anvender en lignende tilgang til V-bundede plade-systemer, men den mindre størrelse af mikrobrøndene (i denne protokol hver har en bredde på 400 um) muliggør generering af et større antal ensartede aggregater fra en enkelt kultur-plade brønd (standard diameter på ~ 15,5 mm indeholdende ~ 1.200 mikrobrønde), end det ville blive genereret fra en hel V-bundplade 10. Well-baserede aggregatdannelse har været anvendt i en række indstillinger, herunder differentiering af hPSCs at ektodermal 11, endodermal 12, mesodermale 13 og extraembryonic 14 skæbner; chondrogenese fra mesenchymstamceller 15; generation af ensartede substrater for toksikologisk screening 16; og undersøgelser af mechanobiology 17.
En stor udfordring i at udvikle robuste fremstilling protokoller til produktion af hPSC-afledte cardiomyocytes har været manglen på reproducerbarhed i hjertets differentiering effektivitet mellem kørsler. Vi har tidligere vist, at denne variation kan tilskrives heterogenitet i start hPSC befolkning, der omfatter både selvfornyende hPSCs og differentiere celler, der udtrykker gener forbundet med endoderm og neural differentiering 6,18. Signaler udskilt af disse differentierende celler påvirker hjerte- induktion. Specifikt extraembryonic endoderm fremmer kardial induktion, mens neurale progenitorer inhiberer kardial induktion. Ved hPSC sammenlægning, celler inden den samlede differentiere og organisere så udifferentierede hPSCs er omgivet af et lag af extraembryonic endoderm celler, der udvikler på den samlede overflade 13. Ved at kontrollere aggregat størrelse, kan vi modulere forholdet mellem hjerte–inducerende endoderm celler til udifferentierede hPSCs (overfladeareal til volumenforhold) og optimere dette forhold for maksimal kardial induktion 13.
Det er blevet observeret, at en effektiv hjertefunktion differentiering af pluripotente stamceller er en meget variabel proces. Mens det ikke er overraskende, at forskellige cellelinier udviser varierende tilbøjeligheder til differentiering kapacitet til specifikke celletyper, er det blevet observeret, at hjertedifferentiering effektivitet svinger dramatisk mellem replikat testkørsler med den samme cellelinje 6. Protokollen beskrevet her omhandler en væsentlig kilde til denne variation ved direkte styring af input celle antal pr aggregat. For yderligere at reducere variabiliteten mellem kørsler, anbefales det, at hPSC strækninger udbygget til enkelt celle passage anvendes, da denne form for hPSC udbygning og vedligeholdelse resulterer i mere konsistente pluripotente populationer med hensyn til ekspressionsfrekvenser af pluripotens markører (f.eks Oct4, Nanog, Tra-1-60, osv.).
Protokollen som skrevet her angiver en samlet størrelse på 1000 celler for optimal kardial induktion fra HES-2 embryonale stamceller linje. For at anvende denne protokol til forskellige cellelinjer, er det afgørende, at en indledende screening aggregat størrelse udføres for at bestemme cellelinje-specifikke optimale samlede størrelse. Selv om det ikke direkte indflydelse de procedurer, der skal følges her, vi minde læseren om, at ændringer i den samlede størrelse og samlede celletæthed forventes at påvirke ilt levering. Dette kan blive en relevant overvejelse i efterfølgende anvendelser. Derudover apoptotisk celledød er en bekymring under dissociation af hPSCs til enkelte celler. Derfor er det afgørende at sikre, at ROCK inhibitor er til stede under tvungen celleaggregering i mikrobrøndene. Endelig er det afgørende, at på dag 4 af differentiering aggregaterne er godt vasket for at fjerne spor Activin A, til stede i induktionen 1 Medium, før resuspension i Induction 2 Medium. Efter dag 4 af differentiering, Activin A fremmer endoderm differentiering på bekostning af mesoderm induktion 20.
Den vigtigste anvendelse af denne teknik er at screene aggregatstørrelser der fremmer effektiv hjertedifferentiering. Men en af begrænsningerne ved det nuværende teknik er, at det er udfordrende at skalere hjerte- produktion til klinisk relevante niveauer ved hjælp mikrobrøndsplader. Opskalering af hjertedifferentiering udføres typisk i løs dyrkningsbetingelser i omrørt suspension bioreaktorer 21. Derfor, når det mikrobrønd system er blevet anvendt til at bestemme acceptable intervaller af aggregatstørrelse for effektiv hjertefunktion induktion, det næste skridt at opskalere er at bestemme bioreaktor rotorhastigheder, der kan generere den ønskede celleaggregatstørrelse.
En af de signifikante forskelle i denne teknik med hensyn til andre fremgangsmåder til aggregat-baserede hjertedifferentiering er, at den muliggør direkte undersøgelser modulering af virkningerne af endogen signalering i aggregater samtco-dyrkning af induktive / inhibitoriske vævstyper med hPSCs i aggregatet 13. Disse typer af undersøgelser kan informere procesudvikling af stor skala hjerte-produktion.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.
Biological safety cabinet | |||
Pipette aid | |||
Serological pipettes (5 to 25 mL) | |||
Aspirator | |||
Aspirator or Pasteur pipettes | |||
15 and 50 mL conical tubes | |||
Fume hood | |||
0.22 µm syringe filter | |||
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
Bench-top microcentrifuge | |||
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Vortex | |||
Ice | |||
-20C freezer | |||
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
Transferrin | Roche | 10652202001 | |
BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
100X Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
100X L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
Hemocytometer | |||
Trypan Blue | |||
Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
96 well plate (for FACS staining) | |||
Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
5 mL round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |