परम्परागत तरीकों मानव pluripotent के निलंबन कुल आधारित भेदभाव हृदय कोशिकाओं (hPSCs) कुल आकार और आकृति के संबंध में संस्कृति विविधता से त्रस्त हैं उपजी आरंभ करने के लिए। यहाँ, हम हृदय भेदभाव microwells रोजगार उत्पन्न करने के लिए आकार नियंत्रित hPSC हृदय को बढ़ावा देने की शर्तों के तहत सुसंस्कृत समुच्चय के लिए एक मजबूत विधि का वर्णन है।
Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.
इन विट्रो सेल संस्कृति में तौर तरीकों की एक संख्या के तहत किया जा सकता है, लेकिन आम तौर पर या तो दो-आयामी पक्षपाती की स्थिति में या तीन आयामी निलंबन की स्थिति है कि पूरी तरह से अधिक विवो प्रणालियों में पुनरावृत्ति में किया जाता है। नतीजतन वहां अनुसंधान के कई क्षेत्रों में एक प्रवृत्ति बढ़ रही तीन आयामी ऊतक निर्माणों पैदा करने के लिए मजबूत तरीकों को विकसित करने के लिए है। परिदृश्यों जहां प्रकार की कोशिकाओं और प्रक्रियाओं के एक सहायक बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) सतह और आसंजन संकेतों की आवश्यकता होती है, तीन आयामी संस्कृति scaffolded निर्माणों, जहां कोशिकाओं पर या एक exogenous मैट्रिक्स 1 समर्थन में सुसंस्कृत हैं के माध्यम से सक्रिय किया जा सकता है। प्रकोष्ठों और प्रक्रियाओं है कि एक सहायक मैट्रिक्स के लिए आसंजन की आवश्यकता नहीं है, मुख्य रूप से या कोशिकाओं 2,3 (जो तब अपने स्वयं के अंतर्जात matrices उत्पन्न करने के लिए आगे बढ़ सकते हैं) की विशेष रूप से बना unscaffolded सिस्टम के रूप में निलंबन में बाहर किया जा सकता है। यहाँ, हम हृदय भेदभाव ओ के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुतएफ मानव स्टेम कोशिकाओं – आकार नियंत्रित, वर्दी, unscaffolded समुच्चय में (hPSCs भ्रूण या अन्य स्रोतों से शरीर में किसी भी प्रकार की कोशिका बनने के काबिल कोशिकाओं, चाहे स्टेम)।
निलंबन समुच्चय के रूप में hPSCs के भेदभाव कुल आकार में बड़े बदलाव दोनों एक रन के भीतर और रन के बीच से ग्रस्त है। इस परिवर्तनशीलता विधि आम तौर पर इन समुच्चय उत्पन्न करने के लिए कार्यरत हैं, जो सेल कालोनियों के यांत्रिक हदबंदी शामिल है का परिणाम है। इस परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, दृष्टिकोण के एक नंबर कुल प्रति कोशिकाओं की संख्या के साथ ही कुल व्यास और एकरूपता को नियंत्रित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। उदाहरण microcentrifuge ट्यूबों 4 में समुच्चय के गठन शामिल है या फांसी बूंदों के रूप में 5, micropatterning दो आयामी hPSC कालोनियों 6, या यू या वि नीचे बहु अच्छी तरह प्लेटें 7.8 में कोशिकाओं के centrifugation जो फिर निलंबन को हस्तांतरित किया जा सकता है परिभाषित 9। हालांकि, इन सभी approaches कुल पीढ़ी के अपने कम throughput द्वारा सीमित हैं। खैर आधारित प्रणाली वी के नीचे प्लेट सिस्टम के लिए एक समान दृष्टिकोण है, तथापि microwells के छोटे आकार को रोजगार (इस प्रोटोकॉल में प्रत्येक 400 माइक्रोन की चौड़ाई वाले) अच्छी तरह से एक ही संस्कृति-थाली से वर्दी समुच्चय की बड़ी संख्या की पीढ़ी के लिए सक्षम बनाता है की तुलना में एक पूरी वी के नीचे प्लेट 10 से उत्पन्न हो जाएगा (~ 15.5 मिमी युक्त ~ 1,200 microwells के मानक व्यास)। खैर आधारित कुल गठन 11, endodermal 12, 13 और mesodermal extraembryonic 14 भाग्य बहिर्जनस्तरीय को hPSCs के भेदभाव सहित सेटिंग्स की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है; mesenchymal स्टेम सेल 15 से उपास्थिजनन; विषाक्तता स्क्रीनिंग 16 के लिए वर्दी substrates की पीढ़ी; और mechanobiology 17 की जांच।
hPSC व्युत्पन्न cardiom के उत्पादन के लिए मजबूत विनिर्माण प्रोटोकॉल के विकास में एक बड़ी चुनौतीyocytes रन के बीच हृदय भेदभाव दक्षता में reproducibility की कमी की गई है। हम पहले से दिखा दिया है कि इस परिवर्तनशीलता शुरू hPSC आबादी है, जो दोनों स्वयं renewing hPSCs और फर्क कोशिकाओं है कि एण्डोडर्म और तंत्रिका भेदभाव 6,18 के साथ जुड़े जीन का इजहार शामिल हैं में विविधता के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है। इन फर्क कोशिकाओं द्वारा स्रावित सिग्नल हृदय प्रेरण प्रभाव। विशेष रूप से, extraembryonic एण्डोडर्म, हृदय प्रेरण को बढ़ावा देता है, जबकि तंत्रिका progenitors हृदय प्रेरण रोकना। HPSC एकत्रीकरण पर, कुल अंतर के भीतर कोशिकाओं और व्यवस्थित है कि अविभाजित hPSCs extraembryonic एण्डोडर्म कोशिकाओं है कि कुल सतह 13 पर विकसित की एक परत से घिरे हैं। कुल आकार को नियंत्रित करके, हम अविभाजित hPSCs (मात्रा के अनुपात में सतह क्षेत्र) को हृदय उत्प्रेरण एण्डोडर्म कोशिकाओं के अनुपात से मिलाना कर सकते हैं और अधिकतम हृदय की प्रेरण 13 के लिए इस अनुपात का अनुकूलन।
यह देखा गया है कि स्टेम कोशिकाओं के कुशल हृदय भेदभाव एक अत्यधिक चर प्रक्रिया है। हालांकि यह आश्चर्य की बात नहीं है कि अलग-अलग सेल लाइनों विशिष्ट प्रकार की कोशिकाओं को भेदभाव क्षमता के लिए अलग-अलग प्रवृत्तियों का प्रदर्शन, यह देखा गया है कि हृदय भेदभाव दक्षता को दोहराने के बीच नाटकीय रूप से बदलता रहता है एक ही सेल लाइन 6 का उपयोग कर चलाता है। यहां वर्णित प्रोटोकॉल सीधे कुल प्रति इनपुट कक्ष संख्या को नियंत्रित करने के द्वारा इस परिवर्तनशीलता का एक प्रमुख स्रोत संबोधित करते हैं। आगे रन के बीच परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए, यह सिफारिश की है कि hPSC लाइनों एकल कक्ष passaging के लिए अनुकूलित pluripotency मार्करों की अभिव्यक्ति आवृत्तियों (जैसे, Oct4, Nanog के लिए सम्मान के साथ और अधिक सुसंगत pluripotent आबादी में hPSC विस्तार और रखरखाव के परिणामों के इस फार्म के रूप में उपयोग किया जाता है, ट्रा-1-60, आदि।)।
प्रोटोकॉल के रूप में यहाँ लिखा ओ के लिए 1,000 कोशिकाओं की कुल आकार को निर्दिष्टHES -2 भ्रूण स्टेम सेल लाइन से ptimal हृदय प्रेरण। अलग सेल लाइनों के लिए इस प्रोटोकॉल लागू करने के लिए, यह है कि एक प्रारंभिक कुल आकार स्क्रीन सेल लाइन-विशिष्ट इष्टतम कुल आकार का निर्धारण किया जाना महत्वपूर्ण है। यह सीधे प्रक्रियाओं को प्रभावित नहीं करता है, जबकि यहाँ का पालन किया जाना है, हम पाठक है कि कुल आकार और कुल मिलाकर सेल घनत्व में परिवर्तन ऑक्सीजन वितरण को प्रभावित करने की उम्मीद कर रहे हैं याद आती है। यह बहाव के अनुप्रयोगों में एक प्रासंगिक विचार हो सकता है। इसके अतिरिक्त, apoptotic कोशिका मृत्यु एकल कक्षों के लिए hPSCs की हदबंदी के दौरान एक चिंता का विषय है। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए कि रॉक अवरोध microwells में मजबूर सेल एकत्रीकरण के दौरान मौजूद है महत्वपूर्ण है। अंत में, यह है कि भेदभाव के 4 दिन पर समुच्चय में अच्छी तरह से पता लगाने Activin ए, प्रेरण 1 मीडियम में मौजूद है, को दूर करने के लिए प्रेरण 2 मध्यम में मेजबान से पहले धो रहे हैं महत्वपूर्ण है। भेदभाव के 4 दिन बाद, Activin एक मेसो की कीमत पर एण्डोडर्म भेदभाव को बढ़ावा देता हैकेंचुल प्रेरण 20।
इस तकनीक का मुख्य आवेदन कुल आकार है कि कुशल हृदय भेदभाव को बढ़ावा देने स्क्रीन है। हालांकि, मौजूदा तकनीक की सीमाओं में से एक यह है कि यह microwell प्लेट का उपयोग कर चिकित्सकीय प्रासंगिक स्तर तक हृदय उत्पादन पैमाने पर करने के चुनौतीपूर्ण है। हृदय भेदभाव के पैमाने को आम तौर पर उभारा निलंबन बायोरिएक्टर 21 में थोक संस्कृति की स्थिति में किया जाता है। इसलिए, एक बार microwell प्रणाली कुशल हृदय शामिल करने के लिए कुल आकार की स्वीकार्य सीमाओं का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, ऊपर पैमाने पर करने के लिए अगले कदम बायोरिएक्टर प्ररित करनेवाला गति है कि वांछित सेल कुल आकार उत्पन्न कर सकते हैं निर्धारित करने के लिए है।
कुल आधारित हृदय भेदभाव के लिए अन्य तरीकों के संबंध में इस तकनीक का महत्वपूर्ण अंतर यह है कि यह समुच्चय में अंतर्जात संकेतन के प्रभाव के नियमन में साथ ही प्रत्यक्ष जांच के लिए सक्षम बनाता हैकुल 13 में hPSCs साथ प्रेरक / निरोधात्मक प्रकार के ऊतकों के सह संस्कृति। जांच के इन प्रकार के बड़े पैमाने पर उत्पादन की प्रक्रिया हृदय विकास को सूचित कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.
Biological safety cabinet | |||
Pipette aid | |||
Serological pipettes (5 to 25 mL) | |||
Aspirator | |||
Aspirator or Pasteur pipettes | |||
15 and 50 mL conical tubes | |||
Fume hood | |||
0.22 µm syringe filter | |||
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
Bench-top microcentrifuge | |||
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Vortex | |||
Ice | |||
-20C freezer | |||
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
Transferrin | Roche | 10652202001 | |
BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
100X Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
100X L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
Hemocytometer | |||
Trypan Blue | |||
Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
96 well plate (for FACS staining) | |||
Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
5 mL round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |