Konvensjonelle metoder for å initiere suspensjon aggregat basert kardial differensiering av human flerpotent stammer celler (hPSCs) er plaget med kultur heterogenitet med hensyn til aggregatstørrelse og form. Her beskriver vi en robust metode for hjerte differensiering ansette mikro å generere størrelse styrt hPSC aggregater dyrket med hjertefremmende forhold.
Cardiac differentiation of human pluripotent stems cells (hPSCs) is typically carried out in suspension cell aggregates. Conventional aggregate formation of hPSCs involves dissociating cell colonies into smaller clumps, with size control of the clumps crudely controlled by pipetting the cell suspension until the desired clump size is achieved. One of the main challenges of conventional aggregate-based cardiac differentiation of hPSCs is that culture heterogeneity and spatial disorganization lead to variable and inefficient cardiomyocyte yield. We and others have previously reported that human embryonic stem cell (hESC) aggregate size can be modulated to optimize cardiac induction efficiency. We have addressed this challenge by employing a scalable, microwell-based approach to control physical parameters of aggregate formation, specifically aggregate size and shape. The method we describe here consists of forced aggregation of defined hPSC numbers in microwells, and the subsequent culture of these aggregates in conditions that direct cardiac induction. This protocol can be readily scaled depending on the size and number of wells used. Using this method, we can consistently achieve culture outputs with cardiomyocyte frequencies greater than 70%.
In vitro cellekultur kan utføres under en rekke modaliteter, men blir typisk utført enten i todimensjonale adherente betingelser eller i tredimensjonale fjæringsforhold som mer fullstendig rekapitulere in vivo systemer. Følgelig er det en økende trend i mange felt av forskning for å utvikle robuste metoder for å generere tredimensjonale vev konstruksjoner. I situasjoner der celletyper og prosesser krever en støttende ekstracellulære matrix (ECM) overflate og heft signaler, kan tredimensjonale kultur aktiveres via stillaset konstruksjoner, hvor celler dyrkes på eller i en eksogen støtte matrise 1. Celler og prosesser som ikke krever adhesjon til en støttende matrise kan utføres i suspensjon som unscaffolded systemene består hovedsakelig eller utelukkende av celler (som kan deretter fortsette å generere sine egne endogene matriser) 2,3. Her presenterer vi en protokoll for hjerte differensiering of menneskelige pluripotent stamceller (hPSCs – stamceller i stand til å bli noen celletype i kroppen, enten fra embryonale eller andre kilder) i størrelse kontrollerte, uniform, unscaffolded aggregater.
Differensiering av hPSCs som henge aggregater er plaget av store variasjoner i samlet størrelse både innen og mellom kjøringer. Denne variasjonen er et resultat av fremgangsmåten som typisk anvendes for å generere disse aggregater, som innebærer mekanisk dissosiasjon av cellekolonier. For å redusere denne variasjonen, har en rekke tilnærminger blitt anvendt for å kontrollere antall celler pr aggregat så vel som samlet diameter og ensartethet. Eksempler innbefatter dannelsen av aggregater i mikrosentrifugerør 4 eller som hengende dråper 5, micropatterning definerte todimensjonale hPSC kolonier 6, som deretter kan overføres til suspensjonen, eller sentrifugering av celler i U- eller V-bunn multi-brønnplater 7,8, 9. Men alle disse ca.oaches er begrenset av deres lave gjennomstrømningen av samlet produksjon. Vel-baserte systemer benytter en lignende tilnærming til V-bunnplaten systemer, men den mindre størrelsen på mikrobrønnene (i denne protokollen som hver har en bredde på 400 um) muliggjør genereringen av et større antall ensartede tilslag fra en enkelt kultur-platebrønn (standard diameter på 15,5 mm ~ inneholdende mikro ~ 1200) enn det som ville bli generert fra en hel V-bunnplate 10. Vel basert aggregatdannelse har blitt brukt i en rekke innstillinger, inkludert differensiering av hPSCs til ectodermal 11, endodermal 12, mesodermal 13 og extraembryonic 14 skjebner; chondrogenesis fra stamceller 15; generasjon av ensartede underlag for toksikologisk screening 16; og undersøkelser av mechanobiology 17.
En stor utfordring i å utvikle robuste industri protokoller for produksjon av hPSC-avledet cardiomyocytes har vært mangel på reproduserbarhet i hjerte differensiering effektivitet mellom kjøringer. Vi har tidligere vist at denne variasjon kan skyldes heterogenitet i utgangs hPSC befolkningen, som omfatter både selvfornyende hPSCs og differensiering av celler som uttrykker gener assosiert med endoderm og nevrale differensiering 6,18. Signaler utskilles av disse differensierende celler påvirke hjerte induksjon. Spesielt fremmer extraembryonic endoderm hjertestans induksjon, mens nevrale stamceller hemme hjertets induksjon. Ved hPSC aggregering, celler i den samlede differensiere og organisere slik at udifferensierte hPSCs er omgitt av et lag av extraembryonic endoderm celler som utvikler seg på den samlede overflaten 13. Ved å kontrollere samlede størrelse, kan vi modulere forholdet mellom hjerte-induserende endoderm celler til udifferensierte hPSCs (overflateareal til volumforhold) og optimalisere dette forholdet for maksimal hjerte induksjon 13.
Det har blitt observert at effektiv kardial differensiering av pluripotente stamceller er en svært variabel prosess. Mens det er ikke overraskende at forskjellige cellelinjer som oppviser varierende tilbøyeligheter for differensiering kapasitet til bestemte celletyper, har det blitt observert at kardial differensiering effektivitet varierer dramatisk mellom replikat forsøk ved bruk av den samme cellelinje 6. Protokollen er beskrevet her tar opp en viktig kilde til denne variasjonen ved direkte styre input celle nummer per aggregat. For ytterligere å redusere variabilitet mellom kjøringer, anbefales det at hPSC linjer tilrettelagt for enkelt celle aging brukes, som denne formen for hPSC utvidelse og vedlikehold gir mer konsistente pluripotente populasjoner med hensyn til uttrykk frekvenser av pluripotency markører (f.eks Oct4, Nanog, Tra-1-60, osv.).
Protokollen som skrevet her angir en samlet størrelse på 1000 celler for optimal hjertestans induksjon fra HMS-2 embryonale stamcellelinje. For å anvende denne protokollen til forskjellige cellelinjer, er det avgjørende at en første aggregatstørrelse skjerm utføres for å bestemme den cellelinje-spesifikk optimal aggregatstørrelse. Selv om det ikke direkte påvirke de prosedyrer som skal følges her, vi minne leseren at endringer i samlet størrelse og generell celletetthet er forventet å påvirke oksygentilførsel. Dette kan bli et relevant hensyn på nedstrømsapplikasjoner. I tillegg er apoptotisk celledød et problem under dissosiasjon av hPSCs til enkeltceller. Derfor er det viktig å sikre at ROCK-inhibitoren er til stede under tvungen celle aggregering i mikrobrønnene. Endelig, er det avgjørende at på dag 4 av differensiering aggregatene er godt vasket for å fjerne spor av aktivin A, som er tilstede i Induksjon en Medium, før resuspensjon i Induksjon 2 Medium. Etter dag 4 av differensiering, fremmer activin A endoderm differensiering på bekostning av mesoderm induksjon 20.
Den viktigste anvendelsen av denne teknikken er å skjerme aggregerte størrelser som fremmer effektiv hjertestans differensiering. Imidlertid er en av begrensningene i dagens teknikk som det er utfordrende å skalere hjerte produksjon til klinisk relevante nivåer med mikroplater. Scale opp av hjertestans differensiering er vanligvis utført i bulk dyrkningsforhold i rørt suspensjon bioreaktorer 21. Derfor, når mikro systemet har blitt benyttet for å bestemme akseptable nivåer av aggregatstørrelse for effektiv hjerte induksjon, er neste trinn å skalere opp, er å bestemme bioreaktor løpehjulhastigheter som kan generere den ønskede celleaggregatstørrelse.
En av de vesentlige forskjeller i denne teknikk med hensyn til andre fremgangsmåter for aggregatbasert hjerte differensiering er at den muliggjør direkte undersøkelser modulerende effekter av endogent signalering i aggregater samtco-kultur induktive / hemmende vevstyper med hPSCs i samlet 13. Disse typer undersøkelser kan informere prosessutvikling i stor skala hjerte produksjon.
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Peter Zandstra, in whose laboratory this protocol was developed, and Drs. Mark Gagliardi and Gordon Keller who provided assistance in establishing the initial methods on which this process was based. Protocol development was supported by an Ontario Graduate Scholarship in Science and Technology to C.B. and a grant from the Heart and Stroke Foundation of Ontario to Peter Zandstra.
Biological safety cabinet | |||
Pipette aid | |||
Serological pipettes (5 to 25 mL) | |||
Aspirator | |||
Aspirator or Pasteur pipettes | |||
15 and 50 mL conical tubes | |||
Fume hood | |||
0.22 µm syringe filter | |||
5% CO2, 5% O2, and humidity controlled cell culture incubator | Hypoxic (low oxygen) incubator | ||
5% CO2, 20% O2, and humidity controlled cell culture incubator | |||
Low speed centrifuge with a swinging bucket rotor fitted with a plate holder | |||
P2, P20, P200, and P1000 micropipettors and associated tips | |||
Inverted microscope with 4X, 10X and 20X phase objectives | |||
Ultra-Low Attachment (ULA) 24 well plates | Corning/Costar | 3473 | |
1.5 mL microcentrifuge tubes | |||
Bench-top microcentrifuge | |||
L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
Sterile Ultrapure distilled water | Sigma-Aldrich | W3500 | |
Vortex | |||
Ice | |||
-20C freezer | |||
Monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | Toxic; Aliquoting of MTG is strongly recommended to minimize oxidation due to repeated opening. Aliquots can be stored at 4 °C for up to 3 months, -20 °C is recommended for long-term storage. |
StemPro-34 Medium | Thermo Fisher Scientific | 10639-011 | Basal Cardiac Induction Medium; The supplement is stored at -20 °C and the basal medium at 4 °C. |
Transferrin | Roche | 10652202001 | |
BMP-4 | R&D Technologies | 314-BP | |
bFGF | R&D Technologies | 233-FB | |
VEGF | R&D Technologies | 293-VE | |
Activin A | R&D Technologies | 338-AC | |
IWP-2 | Reagents Direct | 57-G89 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Thermo Fisher Scientific | 15561 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | Corrosive |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12660 | |
100X Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140 | |
100X L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher Scientific | 10828010 | |
TrypLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563 | Dissociation enzyme |
Hemocytometer | |||
Trypan Blue | |||
Aggrewell 400 plates | StemCell Technologies | 27845 | Microwell Plates |
Aggrewell Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | Microwell Rinsing Solution |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Tocris | 1254 | |
Collagenase Type II | Sigma-Aldrich | C6885 | |
Hank's Balanced Salt Solution | Thermo Fisher Scientific | 14025092 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 12483 | |
96 well plate (for FACS staining) | |||
Intraprep Permeabilization Reagent | Beckman Coulter | IM2389 | Kit with 2 parts: Fixation Solution and Permeabilization Solution; Toxic |
cTnT antibody | Neomarkers | MS-295 | |
goat anti-mouse-IgG APC antibodyThermoFisher | Molecular Probes | A865 | |
5 mL round bottom flow cytometry tubes | FACS machine dependent |