Denne artikkelen beskriver en tilpasningsdyktig ex vivo-protokollen for å visualisere Ca 2+ i løpet egg aktivering i Drosophila.
Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a ‘Ca2+ wave’. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.
En endring i intracellulær Ca 2+ konsentrasjon på egg (eggcelle) aktivering er en fredet del av alle undersøkte organismer 1,2. Dette arrangementet initierer et bredt spekter av Ca2 + -avhengige prosesser, herunder gjenopptakelse av cellesyklusen og translasjon av mRNA som er lagret. På grunn av dette kravet for Ca 2+, visualisere forbigående endringer i intracellulære Ca 2+ konsentrasjon har vært av avgjørende interesse.
Historisk sett ble modellorganismer valgt for studier av egg aktivisering basert på størrelsen og tilgjengeligheten av eggene sine. Forskjellige visualiserings tilnærminger har blitt benyttet for å følge og kvantifisere endringer i intracellulær Ca2 + konsentrasjoner i disse systemer, herunder: den photoprotein aequorin i medaka fisk 3; Ca 2+ sensitive fluorescerende fargestoffer som Fura-2 i kråkeboller og hamster 4,5; og kalsium green-en-dekstran i Xenopus 6.
Den generasjonen og forbedring av genetisk kodede kalsium indikatorer (GECIs) har forvandlet evne til å visualisere Ca 2+ dynamikk in vivo 7. Disse genkonstruksjoner er uttrykt i spesifikke vev og minimalisere behovet for invasive vevspreparater 8.
GCaMPs er et grønt fluorescerende protein (GFP) -basert klasse av GECIs som har vært meget effektiv på grunn av deres høye affinitet Ca2 +, signal-til-støyforhold og evne til å tilpasses 9-11. I nærvær av Ca 2+, gjennomgår GCaMP komplekset en serie av konformasjonsendringer, som starter med bindingen av Ca 2+ til kalmodulin, som resulterer i en øket fluorescerende intensitet av GFP-komponenten 9.
GCaMPs har vært mye brukt i forskning på Drosophila nevroner å visualisere endringer i intracellulær kalsium 12. De siste applicatipå av GCaMP teknologi for å visualisere Ca 2+ i modne Drosophila egg har avdekket en eneste forbigående Ca 2+ bølge på egg aktivisering 13,14. Ca 2+ bølge kan visualiseres ved lav forstørrelse under eggløsningen in vivo 13 eller ved høyere forstørrelse ved hjelp av en ex vivo aktiveringstest 13,14. I ex vivo-forsøk, blir de enkelte modne oocytter isolert fra ovariene og aktivert ved hjelp av en hypoton løsning, betegnet som aktiveringsbuffer, som har vist seg å rekapitulere hendelsene i in vivo aktivering 15-17.
Denne ex vivo-analyse gjør det enkelt høyoppløselig visualisering av Ca 2+ bølgen ved ulike eksperimentelle forhold, inkludert farmakologiske avbrudd, fysiske manipulasjoner og genetiske mutanter. Denne artikkelen viser fremstilling av modne Drosophila egg for ex vivo aktivering og the påfølgende mikroskopi brukes til å visualisere Ca 2+ bølge hjelp GCaMP. Denne tilnærmingen kan brukes for å teste initiering og kontroll av Ca 2 + bølge og å probe nedstrøms resultater.
The first critical step in this protocol is isolating the mature eggs without damage. This can be achieved by gentile maneuvering of the eggs with the dissecting probe. Practice will enable this manipulation to be executed without damage to the eggs. A second crucial step is avoiding the loss of the sample when activation buffer is applied to the mature egg in oil. Application of the activation buffer should be done slowly and without contact with the coverslip. This step can be challenging if the microscope set-up does not allow for an easy access to the sample. Moving axillary parts of the microscope, such as a temperature incubator, is advisable.
Modifications to this protocol can be made in order to visualize other fluorescently tagged factors, instead of Ca2+ at egg activation. More generally, different stages of Drosophila development or the results of adding a different buffer could be analyzed using this protocol.
Troubleshooting may be required if the settings on the microscope are not optimal for visualizing the signal from the sample. This can be achieved by increasing or decreasing the laser power, altering capture range and adjusting the Z-stack parameters. Another issue might be eggs consistently moving out of the field of view upon the addition of activation buffer. If this happens regularly, allow the mature eggs to settle on the coverslips for a longer period of time, 15 to 20 minutes. Beware that using a higher viscosity oil will alter the displacement of the oil by activation buffer.
This technique presented here is limited by the working distance of the objective, dehydration of the mature eggs and the ability to dissect the mature eggs without damage. However, when compared to in vivo imaging methods where the mature oocyte passes through the adult female and is deposited 13, our method enables more spatial resolution, the option to physically manipulate the mature egg before activation and the ability to test the role of egg activation without fertilization.
There are many potential future applications of this technique, including testing reporter constructs for cellular components at egg activation and visualizing the Ca2+ wave in mutant backgrounds 14,24. Together with experimental and genetic tools, the ex vivo egg activation assay presented here enables the study of the trigger, propagation and downstream effects of the universally conserved Ca2+ wave.
The authors have nothing to disclose.
Vi er takknemlige for Laura Bampton, Alex Davidson, Richard Parton, Arita Acharya for bistand under forberedelsen av dette manuskriptet; Mariana Wolfner for diskusjoner om egg aktivering; Matt Wayland for bildebehandling støtte; og Nan Hu for generell støtte i laboratoriet.
Dette arbeidet ble støttet av University of Cambridge, ISSF til TTW [tilskuddet nummer 097814].
Dry active yeast | Fleischman’s | #2192 | |
Dissecting microscope | Leica | MZ6 | Various will work |
Lamp | Mircotec Fibre optic | MF0-90 | Various will work |
Medical wipes | Kimberly-Clark Corporation | KLEW3020 | |
Marker pen | Stabilo | 841/46 | OHPen universal, black – available in most stationary shops. Superfine Width 0.4mm |
CO2 pad | Genesee Scientific | 59-114 (789060 Dutscher) | |
Cover slip No. 1.5, 22 x 50mm | International- No1-VWR Cat=631-0137-22-50mm | Menzel-Glaser-22-50mm-MNJ 400-070T | |
Halocarbon oil, series 95 | Halocarbon Products Corp. | Distributor in Europe: | |
Solvadis (GMBH) | |||
Oil 10 S | VWR Chemicals | 24627.188 | Can be used instead of Halocarbon oil, series 95 |
Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | Whilst these tool should be clean, use of an autoclave is not necessary, ethanol would be sufficient. |
Probe | Fine Science Tools | 10140-01 | |
Glass pipette | Fisherbrand, | FB50251 | Pasteur Pipettes, glass, unplugged, 150mm length |
Vial | Regina Industries | P1014 | GPPS 80mm x 25mm |