Utarbeidelse og karakterisering av lipofile Doxorubicin Pro-stoff Miceller
Summary
En protokoll for utarbeidelse og karakterisering av lipofile doxorubicin pro-drug lastet 1,2-distearoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine- N – [amino (polyetylenglykol) -2000] (DSPE-PEG) miceller er beskrevet.
Abstract
Micelles have been successfully used for the delivery of anticancer drugs. Amphiphilic polymers form core-shell structured micelles in an aqueous environment through self-assembly. The hydrophobic core of micelles functions as a drug reservoir and encapsulates hydrophobic drugs. The hydrophilic shell prevents the aggregation of micelles and also prolongs their systemic circulation in vivo. In this protocol, we describe a method to synthesize a doxorubicin lipophilic pro-drug, doxorubicin-palmitic acid (DOX-PA), which will enhance drug loading into micelles. A pH-sensitive hydrazone linker was used to conjugate doxorubicin with the lipid, which facilitates the release of free doxorubicin inside cancer cells. Synthesized DOX-PA was purified with a silica gel column using dichloromethane/methanol as the eluent. Purified DOX-PA was analyzed with thin layer chromatography (TLC) and 1H-Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (1H-NMR). A film dispersion method was used to prepare DOX-PA loaded DSPE-PEG micelles. In addition, several methods for characterizing micelle formulations are described, including determination of DOX-PA concentration and encapsulation efficiency, measurement of particle size and distribution, and assessment of in vitro anticancer activities. This protocol provides useful information regarding the preparation and characterization of drug-loaded micelles and thus will facilitate the research and development of novel micelle-based cancer nanomedicines.
Introduction
Kjemoterapi er vanligvis brukes til å behandle ulike former for kreft. De fleste, om ikke alle, cytostatika har toksiske bivirkninger som kan variere fra håndterbare mindre forhold, slik som kvalme og diaré, til mer livstruende tilstander. Fordi de fleste antikreftmidler er giftige, ikke-selektiv eksponering av disse stoffene med normalt vev uunngåelig fører til toksisitet. Det er derfor et stort behov for en terapeutisk tilnærming som selektivt kan levere medikamenter inn i kreftceller. En annen utfordring med administrasjon av legemidler mot kreft er deres dårlige løselighet i vann. Vanligvis er oppløsningsmidler nødvendig for å formulere disse dårlig oppløselige medikamenter. Imidlertid kan de fleste oppløsningsmidler, slik som dimetylsulfoksid (DMSO), Cremophor EL, og Polysorbat 80 (Tween 80) forårsake lever-og nyretoksisitet, hemolyse, akutte hypersensitivitetsreaksjoner og perifere nevropatier. 1 er derfor sikker og biokompatible formuleringer som trengs for klinisk bruk av dårligly løselige kreftmedisiner. Nanocarriers er lovende stoffet leveringssystemer for å ivareta de ovennevnte utfordringer. Disse nanocarriers inkluderer liposomer, 2 nanopartikler, 3 miceller, 4-7 polymer-legemiddelkonjugater, 8 og uorganiske materialer. 9 flere nanomedisin produkter (f.eks Doxil, Abraxane, og Genexol) har blitt godkjent av regulatoriske myndigheter for å behandle kreftpasienter. 10
Polymer miceller er lovende nano-skala stoffet levering bærere, som har blitt brukt for levering av kreftmedisiner. 4-7,11,12 Typiske polymere miceller er forberedt fra amfifile polymerer gjennom en selvmonteringsprosessen. De kjerne-skall strukturerte polymere micellene omfatter et hydrofilt skall og en hydrofob kjerne. Den hydrofile skallet kan sterisk stabil miceller og forlenge deres sirkulasjon i blodet. Den hydrofobe kjerne effektivt kan kapsle hydrofobe dtepper. På grunn av den lille størrelsen av miceller (typisk mindre enn 200 nm) og lang-sirkulasjon egenskaper, polymere miceller antas å oppnå målretting mot tumor gjennom økt permeabilitet og retensjon (EPR) virkninger (passiv tumor målretting).
Medikamentbelastning stabilitet er kritisk for tumor målretting evne til miceller. For å oppnå optimal svulst målretting, bør miceller ha minimal narkotika lekkasje før de når svulsten nettstedet, men likevel raskt frigjøre medikamentet etter å ha tastet kreftceller. I tillegg er preparatet stabilitet også en viktig forutsetning for produktutvikling, fordi formulering stabilitet bestemmer gjennomførbarheten av produktutvikling, samt holdbarheten av utviklede produkter. Nylig har mye arbeid blitt gjort for å forbedre lastingen av narkotika inn leverings bærere. Den lipofile pro-drug tilnærming er en strategi som har vært utforsket for å bedre legemiddelmengde i lipid nanopartikler og emulsjoner. 13,14 The conjugation av lipider med medikamenter kan forbedre sin lipofilisitet og forbedre lasting og oppbevaring i lipofile komponenter nanocarriers.
Her beskriver vi en protokoll for å forberede lipofile doxorubicin pro-narkotika lastet miceller. Først blir synteseprosedyre for doksorubicin lipofilt pro-legemiddel er beskrevet. Deretter blir en protokoll for generering av miceller med en film-dispersjon metode innføres. Denne fremgangsmåten har blitt brukt i vår tidligere studier. 5 DSPE-PEG ble valgt som bæremateriale for fremstilling av miceller, fordi det har blitt brukt for micelle legemiddelavlevering. 15,16 Til slutt beskriver vi flere vitro forsøk i som brukes til å karakterisere micelle formuleringer og for å evaluere anticancer aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
I dette arbeidet, beskriver vi en ukomplisert, hurtig film-dispersjon fremgangsmåte for fremstilling av miceller. Denne metoden benytter selvbygging egenskaper av en amfifil polymer (f.eks DSPE-PEG) for å danne kjerne-skall strukturert miceller i et vandig miljø. Dette micelle fremstillingsmetode har flere fordeler. 1. Det innebærer en enkel formulering prosess, noe som unngår bruk av kompliserte størrelse-reduksjonstrinn (for eksempel ekstrudering eller homogenisering) som vanligvis brukes ved fremstilli…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the following grants: NIH-SC3 grant, NSF-PREM grant, Hampton University Faculty Research Grant. We would like to thank Mrs. Michele A. Cochran at Virginia Institute of Marine Science (VIMS) for the use of the particle size analyzer. We would also like to thank Mrs. Corinne R. Ramaley for reviewing the manuscript.
Materials
| DSPE-PEG2K | Cordenpharm | LP-R4-039 | >95% |
| Doxorubicin | LC Laboratories | D-4000 | >99% |
| Palmitic Acid Hydrazide | TCI AMERICA | P000425G | >98.0% |
| Methanol | ACROS Organics | 610981000 | Anhydrous |
| Methylene chloride | FISHER | D151-4 | 99.90% |
| Methyl sulfoxide-d6 | ACROS Organics | AC320760075 | NMR solvent |
| Trifluoroacetic Acid | ACROS Organics | AC293811000 | 99.50% |
| Silica Gel | FISHER | L-7446 | 230-400 mesh |
| BAKER FLEX TLC PLATES | FISHER | NC9990129 | |
| DPBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| DU 145 Prostate Cancer Cells | ATCC | HTB-81 | |
| MTT | ACROS Organics | 158990050 | 98% |
| RPMI 1640 Medium | MEDIATECH INC | 10041CV | |
| Antibiotic-Antimycotic | LIFE TECHNOLOGIES | 15240062 | 100x stock solution |
| Fetal Bovine Serum | LIFE TECHNOLOGIES | 10437077 | |
| Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy | Varian, Inc | 300 NMR | |
| Büchi R-3 Rotavapor | Buchi | 1103022V1 | Rotary evaporator |
| Ultrasonic Bath | BRANSON ULTRASONICS CORPORATION | CPX952318R | |
| UV-VIS spectrometer Biomate 3 | Thermo Spectronic | ||
| Zetasizer Nano ZS90 | Malvern Instruments | Particle Size Analyer | |
| Microplate Spectrophotometer | Rio-Rad | Benchmark Plus | |
| Cell Culture Incubator | Napco | CO2 6000 | |
| Biological Safety Cabinet | Nuaire | ||
| SigmaPlot | Systat Software, Inc. | Analytical Software | |
| 96-Well Cell Culture Plate | Becton Dickinson | 353072 | |
| Trypsin 0.25% | Corning Cellgro | 25-053-CI |
Riferimenti
- Hennenfent, K. L., Govindan, R. Novel formulations of taxanes: a review. Old wine in a new bottle?. ESMO. 17 (5), 735-749 (2006).
- Paliwal, S. R., Paliwal, R., Agrawal, G. P., Vyas, S. P. Liposomal nanomedicine for breast cancer therapy. Nanomedicine. 6 (6), 1085-1100 (2011).
- Mahapatro, A., Singh, D. K. Biodegradable nanoparticles are excellent vehicle for site directed in vivo delivery of drugs and vaccines. J Nanobiotechnology. 9 (55), (2011).
- Danquah, M., Li, F., Duke, C. B., Miller 3rd, ., D, D., Mahato, R. I. Micellar delivery of bicalutamide and embelin for treating prostate cancer. Pharm Res. 26 (9), 2081-2092 (2009).
- Li, F., Danquah, M., Mahato, R. I. Synthesis and characterization of amphiphilic lipopolymers for micellar drug delivery. Biomacromolecules. 11 (10), 2610-2620 (2010).
- Li, F., Danquah, M., Singh, S., Hao, W., Mahato, R. Paclitaxel- and lapatinib-loaded lipopolymer micelles overcome multidrug resistance in prostate cancer. Drug Deliv. and Transl. Res. 1 (6), 9 (2011).
- Li, F., Lu, Y., Li, W., Miller, D. D., Mahato, R. I. Synthesis, formulation and in vitro evaluation of a novel microtubule destabilizer, SMART-100. J Control Release. 143 (1), 151-158 (2010).
- Minko, T., Kopeckova, P., Pozharov, V., Kopecek, J. HPMA copolymer bound adriamycin overcomes MDR1 gene encoded resistance in a human ovarian carcinoma cell line. J Control Release. 54 (2), 223-233 (1998).
- Rosenholm, J. M., Mamaeva, V., Sahlgren, C., Linden, M. Nanoparticles in targeted cancer therapy: mesoporous silica nanoparticles entering preclinical development stage. Nanomedicine. 7 (1), 111-120 (2012).
- Kaur, I. P., et al. Issues and concerns in nanotech product development and its commercialization. J Control Release. 193, 51-62 (2014).
- Jones, M., Leroux, J. Polymeric micelles – a new generation of colloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm. 48 (2), 101-111 (1999).
- Wang, H., Li, F., Du, C., Mahato, R. I., Huang, Y. Doxorubicin and lapatinib combination nanomedicine for treating resistant breast cancer. Mol Pharm. 11 (8), 2600-2611 (2014).
- Ma, P., Rahima Benhabbour, S., Feng, L., Mumper, R. J. 2′-Behenoyl-paclitaxel conjugate containing lipid nanoparticles for the treatment of metastatic breast cancer. Cancer Lett. 334 (2), 253-262 (2013).
- Lundberg, B. B., Risovic, V., Ramaswamy, M., Wasan, K. M. A lipophilic paclitaxel derivative incorporated in a lipid emulsion for parenteral administration. J Control Release. 86 (1), 93-100 (2003).
- Perche, F., Patel, N. R., Torchilin, V. P. Accumulation and toxicity of antibody-targeted doxorubicin-loaded PEG-PE micelles in ovarian cancer cell spheroid model. J Control Release. 164 (1), 95-102 (2012).
- Gill, K. K., Kaddoumi, A., Nazzal, S. Mixed micelles of PEG(2000)-DSPE and vitamin-E TPGS for concurrent delivery of paclitaxel and parthenolide: enhanced chemosenstization and antitumor efficacy against non-small cell lung cancer (NSCLC) cell lines. Eur J Pharm Sci. 46 (1-2), 67-71 (2012).
- Still, W. C., Kahn, M., Mitra, A. Rapid Chromatographic Technique for Preparative Separations with Moderate Resolution. J. Org. Chem. 43 (14), 2923-2925 (1978).
- Morton, L. A., Saludes, J. P., Yin, H. Constant pressure-controlled extrusion method for the preparation of Nano-sized lipid vesicles. J Vis Exp. (64), (2012).
- Ulbrich, K., Etrych, T., Chytil, P., Jelinkova, M., Rihova, B. HPMA copolymers with pH-controlled release of doxorubicin: in vitro cytotoxicity and in vivo antitumor activity. J Controlled Release. 87 (1-3), 33-47 (2003).
- Patil, R., et al. Cellular Delivery of Doxorubicin via pH-Controlled Hydrazone Linkage Using Multifunctional Nano Vehicle Based on Poly(beta-L-Malic Acid). Int J Mol Sci. 13 (9), 11681-11693 (2012).
- Hu, X., Liu, S., Huang, Y., Chen, X., Jing, X. Biodegradable block copolymer-doxorubicin conjugates via different linkages: preparation, characterization, and in vitro evaluation. Biomacromolecules. 11 (8), 2094-2102 (2010).
- Huynh, L., Neale, C., Pomes, R., Allen, C. Computational approaches to the rational design of nanoemulsions, polymeric micelles, and dendrimers for drug delivery. Nanomedicine. 8 (1), 20-36 (2012).
- Shi, C., et al. A drug-specific nanocarrier design for efficient anticancer therapy. Nat Commun. 6, 7449 (2015).
