Vergleich von Tabakwirtszellprotein Abbaumethoden von Intact Pflanzen oder Blanchieren durch Wärmebehandlung von Extrakten

Summary

Drei Wärmefällungsverfahren vorgestellt werden, die effektiv mehr als 90% der Wirtszellproteine ​​(HCP) von Tabak entfernen Extrakte vor jeder anderen Reinigungsschritt. Die Anlage HCPs aggregieren irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C.

Abstract

Pflanzen bieten nicht nur Nahrung, Futter und Rohstoffen für Menschen, sondern auch als wirtschaftliche Produktionssystem für biopharmazeutischer Proteine, wie Antikörper, Impfstoffe und Enzymen entwickelt. Diese müssen von der pflanzlichen Biomasse gereinigt werden, sondern Chromatographieschritte werden durch die hohen Konzentrationen von Wirtszellproteinen (HCPs) in Pflanzenextrakten behindert. Jedoch aggregieren meisten HCPs irreversibel bei Temperaturen über 60 ° C erleichtert die anschließende Reinigung des Zielproteins. Hier werden drei Methoden vorgestellt, die Wärme Ausfällung von Tabak HCP entweder in intakten Blättern oder Extrakte zu erzielen. Das Blanchieren von intakten Blättern kann leicht in bestehende Prozesse integriert werden, aber negative Auswirkungen auf die nachfolgende Filtrationsschritte haben können. Das Gegenteil ist für die Wärme Ausfällung von Blattextrakten in einem Rührkessel wahr, der die Performance des Downstream-Aktivitäten, wenn auch mit großen Veränderungen in Prozessanlagen Design verbessern können, wie zum BeispielHomogenisator Geometrie. Schließlich wird ein Wärmetauscher-Setup auch im Hinblick auf die Wärmeübergangsbedingungen und leicht zu Skala gekennzeichnet, aber die Reinigung kann schwierig sein, und es kann einen negativen Einfluss auf die Filterkapazität sein. Das Design-of-Experimente Ansatz können die meisten relevanten Prozessparameter beeinflussen HCP Entfernung und Produktgewinnung zu identifizieren. Dies erleichtert die Anwendung der einzelnen Methoden in andere Expressionsplattformen und die Identifizierung der am besten geeignete Methode für eine gegebene Reinigungsstrategie.

Introduction

Moderne Gesundheitssysteme zunehmend von biopharmazeutischen Proteinen ^1. Herstellung dieser Proteine ​​in Pflanzen ist vorteilhaft , aufgrund der geringen pathogen Belastung und höhere Skalierbarkeit im Vergleich zu herkömmlichen Expressionssysteme ^2-4. Allerdings ist die Downstream-Processing (DSP) von pflanzlichen Arzneimitteln kann eine Herausforderung sein, weil die störenden Extraktionsverfahren in einer hohen Partikelbelastung zur Folge haben, mit Trübungen von mehr als 5.000 nephelometrischen Trübungseinheiten (NTU) und Wirtszellprotein (HCP) Konzentrationen oft 95 überschreitet % [m / m] ^5,6.

Aufwendige Klärungsverfahren sind erforderlich , um dispergierte Teilchen zu entfernen ^7-9, aber Chromatographie Ausrüstung ist weniger teuer in bind-and-eluieren Modus während der anfänglichen Produktgewinnung zu betreiben , wenn ein früherer Schritt für die effiziente Entfernung von HCPs ^10,11 ist. Dies kann entweder erreicht werden, indem das Zielproteinfällungs floccul VerwendungAmeisen ¹² oder niedrigen pH ^13,14 sowie durch die HCPs zu aggregieren verursacht. Die selektive Aggregation von Ribulose-1,5-bisphosphat – Carboxylase / Oxygenase (RuBisCO), das am reichlichsten vorhandene HCP in grünen Pflanzen wie Tabak (Nicotiana tabacum), kann durch Zugabe von Polyethylenglykol ¹⁵ gefördert werden, dies ist jedoch teuer und nicht mit großer -Skala Fertigung. Wärmebehandlung wurde mehr als 95% des Tabaks HCPs gezeigt zu denaturieren und auszufällen, während Protein Malaria – Impfstoffkandidaten wie Vax8 stabil bleiben in Lösung ^16-18.

Drei verschiedene Ansätze wurden verwendet , um die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak HCPs zu erreichen: (i) blanchiert, das heißt das Eintauchen von intakten Blättern in heiße Flüssigkeit, (ii) ein temperaturgesteuertes Gefäß gerührt, und (iii) einen Wärmetauscher ( Abbildung 1) ^16. Für intakte Blätter, Blanchieren der eine schnelle und effiziente Fällung von HCP erreicht und war auch leichtFertigungsprozesse zu skalieren und kompatibel mit bestehenden großen , die einen ersten Schritt umfassen ¹⁹ die pflanzliche Biomasse zu waschen. Im Gegensatz dazu, temperaturgeregelten Behälter sind bereits in einigen Prozessen zur Verfügung und kann für die thermische Behandlung von Pflanzen ²⁰ extrahiert verwendet werden, aber ihre Skalierbarkeit und Energieübertragungsrate begrenzt , weil die Oberfläche-zu-Volumen – Verhältnis der Tanks schrittweise verringert wird und wird im Prozessmaßstab ungeeignet. Ein Wärmetauscher ist ein technisch gut definierte alternative Rührkessel zu erwärmenden erfordert aber eine reichliche Zufuhr von Heiz- und Kühlmedien, beispielsweise Dampf und kaltem Wasser sowie eine streng kontrollierten Volumenstrom, der zu dem Wärmetauscher Geometrie angepasst ist , und Medieneigenschaften, z. B. die spezifische Wärmekapazität. Dieser Artikel zeigt, wie alle drei Methoden können für die wärmeinduzierte Ausfällung von Tabak Vertreter des Gesundheitswesens und Pflanzen Vertreter des Gesundheitswesens im Allgemeinen verwendet werden. Die Errichtung und der Betrieb von each Methode in einer Laborumgebung kann verwendet werden, um ihre Eignung Prozesse für größere zu bewerten. Die große Herausforderung ist für jede Operation, die die Geräte und Bedingungen in angemessenem Umfang verkleinerten Modellen und Betriebsbedingungen zu identifizieren, während im Prozessmaßstab Herstellung verwendeten ähneln. Die hier präsentierten Daten beziehen sich auf Versuche mit transgenen Tabakpflanzen durchgeführt DsRed die Malaria – Impfstoffkandidaten Vax8 und fluoreszierende Protein exprimieren , ^16, aber das Verfahren auch auf N. erfolgreich angewandt wurde benthamiana Pflanzen transient exprimieren andere biopharmazeutische Proteine ^​​21.

Ein Design-of-Experiments (DoE) Ansatz ²² kann die Prozessentwicklung zu erleichtern, und Flockungsmittel ²³ in diesem Zusammenhang auch von Vorteil sein kann , wie zuvor ⁸ beschrieben. Der wesentliche Unterschied zwischen dem Bleichen, dem beheizten Behältern und Wärmetauscher ist, dass Abblassen auf intakte Blätter früh in den Prozess während der ot angewendet wirdihr sind Pflanzenextrakte (Abbildung 1) aufgebracht.

Abb . 1: Fließschema Prozess zeigt die Umsetzung der drei verschiedene Methoden zur Tabak HCP Wärme Precipitation Das Pflanzenmaterial wird gewaschen und homogenisiert vor Klärung und Reinigung. Die Ausrüstung für die Blanchierschritt (rot) leicht an die vorhandenen Maschinen hinzugefügt werden. Im Gegensatz dazu ist ein Rührkessel (orange) mit und insbesondere einen Wärmetauscher (blau) erfordert eine oder mehrere zusätzliche Geräte und Schläuche. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Protocol

1. Pflegen Sie die Tabakpflanzen Schreibt jede Mineralwolle-Block mit 1 bis 2 l entionisiertem Wasser und anschließend mit 1 l von 0,1% [w / v] Düngemittellösung. Legen Sie einen Tabaksamen in jedem Block aus Mineralwolle und sanft bündig mit 0,25 l Düngerlösung ohne den Samen 16 Waschen entfernt. Pflegen Sie die Tabakpflanzen für 7 Wochen in einem Gewächshaus mit 70% relativer Luftfeuchtigkeit, eine 16 Stunden Photoperiode (180 & mgr; mol sec – 1 m …

Representative Results

Wärme Fällung von Tabakwirtszellproteine ​​durch blanchiert Die blanchiert Verfahren in Abschnitt 2 beschrieben, wurde erfolgreich verwendet HCP auszufällen von Tabak mit 70 ° C verlässt, um 96 ± 1% des TSP reduziert (n = 3) während der Genesung zu 51% des Vax8 Zielproteins auf, damit seine zunehmende Reinheit von 0,1% bis 1,2% vor der chromatographischen Trennung 16. Es war auch möglich, 83 ± 1% wiederherzustellen (n = 3) des fluoreszierenden Prot…

Discussion

Die drei Verfahren zur Hitzefällung oben beschrieben , kann effektiv Tabak HCP vor jeder chromatographischen Reinigungsschritt ^16,17 entfernen. Sie ergänzen andere Strategien , die anfängliche Produktreinheit zu erhöhen zielen darauf ab , zum Beispiel Guttation ^29, rhizosecretion ³⁰ oder Zentrifugalextraktion ^31,32, die alle auf sekretierte Proteine ​​beschränkt sind. Jedoch können die Wärmebasierte Verfahren nur dann sinnvoll genutzt werden, wenn das Zielp…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Autoclaving basket	Nalgene	6917-0230	Basket for leaf blanching
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM	Sequip	n.a.	Particle size analyzer
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
CM5 chip	GE Healthcare	BR100012	Chip for SPR measurements
Cuvette 10x10x45	Sarsted	67.754	Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)	n.a. (custom design)	n.a.	Heat exchanger
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K200P 60D	Pall	5302303	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Water bath thermostat
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 specific antibody
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Sodium disulfit	Carl Roth GmbH	8554.1	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm	n.a. (custom design)	n.a.	Container for heat precipitation
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.	Software to operate the Zetasizer Nano ZS device