Confronto di tabacco metodi Host cellulare della proteina di rimozione da Blanching Piante intatte o mediante trattamento termico di estratti

Summary

Tre calore metodi di precipitazione sono presentati che rimuove efficacemente oltre il 90% delle proteine ​​della cellula ospite (HCP) da tabacco estrae prima di qualsiasi altra fase di purificazione. L'impianto di operatori sanitari in modo irreversibile aggregare a temperature superiori a 60 ° C.

Abstract

Le piante non solo forniscono alimenti, mangimi e materie prime per l'uomo, ma sono stati sviluppati come un sistema di produzione economica per le proteine ​​biofarmaceutiche, come gli anticorpi, vaccini candidati ed enzimi. Questi devono essere purificati dalla biomassa vegetale, ma passaggi di cromatografia sono ostacolati dalle alte concentrazioni di proteine ​​della cellula ospite (operatori sanitari) in estratti di piante. Tuttavia, la maggior parte HCPs irreversibilmente aggregano a temperature superiori a 60 ° C agevolare successiva purificazione della proteina bersaglio. Qui, tre metodi vengono presentati per ottenere la precipitazione di calore degli operatori sanitari del tabacco in foglie sia intatte o estratti. Il pallore di foglie intatte può essere facilmente incorporato in processi esistenti, ma può avere un impatto negativo sulle successive fasi di filtrazione. L'opposto è vero per la precipitazione di calore di estratti di foglie in un recipiente agitato, che può migliorare le prestazioni delle operazioni a valle anche se con grandi cambiamenti nella progettazione apparecchiature di processo, qualiGeometria omogeneizzatore. Infine, una configurazione scambiatore di calore è ben caratterizzato in termini di condizioni di trasferimento di calore e facile in scala, ma pulizia può essere difficile e potrebbe esserci un impatto negativo sulla capacità del filtro. L'approccio progettuale-di-esperimenti può essere utilizzato per identificare i parametri di processo più importanti che influenzano la rimozione HCP e recupero del prodotto. Questo facilita l'applicazione di ciascun metodo in altre piattaforme di espressione e l'identificazione del metodo più adatto per una data strategia di purificazione.

Introduction

I moderni sistemi di assistenza sanitaria dipendono sempre più sulle proteine ​​biofarmaceutiche ^1. Produrre queste proteine ​​nelle piante è vantaggioso a causa del basso carico patogeno e maggiore scalabilità rispetto ai sistemi di espressione convenzionali ^2-4. Tuttavia, la lavorazione a valle (DSP) di farmaci di origine vegetale può essere difficile perché le procedure di estrazione dirompenti si traducono in un onere elevato di particelle, con torbidità superiore a 5.000 unità nefelometrica torbidità (NTU), e di proteine ​​della cellula ospite (HCP) concentrazioni spesso superiore a 95 % [m / m] ^5,6.

....

Protocol

1. Coltivare le piante di tabacco

1. Lavare ogni blocco lana minerale con 1 a 2 L di acqua deionizzata e quindi con 1 L di 0,1% [w / v] Soluzione di concime. Mettere un seme di tabacco in ogni blocco lana minerale e delicatamente a filo con 0,25 L di soluzione fertilizzante senza lavare via il seme ^16.
2. Coltivare le piante di tabacco per 7 settimane in una serra con il 70% di umidità relativa, 16 hr fotoperiodo (180 mmol sec ^{- 1} m ^{- 2;} λ = 400 - 700 nm) e un regime di temperatura 25/22 ° C luce / buio.
3. Raccolto tutte le foglie, tranne le quattro foglie cotiledone, che si trovano alla ba....

Results

La precipitazione di calore delle proteine ​​della cellula ospite tabacco da scottatura
La procedura di sbiancamento descritto nella sezione 2. è stato utilizzato con successo per far precipitare operatori sanitari da foglie di tabacco con 70 ° C, la riduzione del TSP del 96 ± 1% (n = 3), mentre il recupero fino al 51% della proteina bersaglio Vax8, aumentando così la sua purezza dal 0,1% al 1,2% prima della separazione cromatografica ^16. Era anche possibile recu.......

Discussion

I tre metodi per la precipitazione di calore sopra descritti possono rimuovere efficacemente operatori sanitari tabacco prima di ogni fase di purificazione cromatografica ^16,17. Esse completano altre strategie che mirano ad aumentare la purezza iniziale del prodotto, ad esempio, guttazione ^29, rhizosecretion ³⁰ o centrifuga estrazione ^31,32, che sono tutti limitati alle proteine ​​secrete. Tuttavia, i metodi di calore a base possono essere usati solo in modo significa.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Torbidimetro portatile 2100P	Hach	4650000	Kit
di accoppiamento per ammina	GE Healthcare	BR100050	Kit di accoppiamento truciolo SPR
Cestello per autoclave	Nalgene	6917-0230	Cestello per scottatura delle foglie
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	Dispositivo SPR
Analizzatore di Bio Cellule BCA 003 R& D con 3D ORM	Sequip	n.a.Analizzatore	granulometrico
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Furh	2632410001	Filtro a maniche
Centrifuga 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuga
Provetta da centrifuga 15 ml	Labomedic	2017106	Provetta di reazione
Provetta da centrifuga 50 ml autoportante	Labomedic	1110504	Tubo di reazione
CM5 chip	GE Healthcare	BR100012	Chip per misure SPR
Cuvetta 10 x 10 x 45	Sarsted	67.754	Cuvetta per Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.Software	DoE
Fosfato disodico	Carl Roth GmbH	4984,3	Componente multimediale
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizzante
Forma -86C ULT congelatore	ThermoFisher	88400
Congelatore	Serra n.a.n.a.Per		la coltivazione di piante
Grodan Rockwool Cubi 10 x 10 cm	Grodan	102446	Rockwool block
Scambiatore di calore a due circuiti (4,8 m di lunghezza)	n.a. (design personalizzato)n.a.Calore		scambiatore
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Componente multimediale
K200P 60D	Pall	5302303	Strato filtrante di profondità
KS50P 60D	Pall	B12486	Strato filtrante di profondità
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Termostato bagnomaria
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubo
mAb 5.2	Tipo americano Collezione di colture	HB-9148	Vax8 anticorpo specifico
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Pompa peristaltica
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Tessuto filtrante
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pHmetro / conduttimetro
Osram bianco freddo 36 W	Osram	4930440	Sorgente luminosa
Phytotron	Ilka Zell	n.a.Per	coltivazione di piante
Disolfito di sodio	Carl Roth GmbH	8554.1	Componente del supporto
Cloruro di sodio	Carl Roth GmbH	P029.2	Componente del supporto
Recipiente in acciaio inossidabile; 0,7 kg 2,0 L; altezza 180 mm; diametro 120 mm	n.a. (design personalizzato)	n.a.Contenitore	per la precipitazione del calore
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Lettore di piastre a fluorescenza e spettrometria
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Alloggiamento del filtro
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS Misurazione della distribuzione granulometrica
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.Software	per il funzionamento del dispositivo Zetasizer Nano ZS