Sammenligning av Tobakks Host Cell Protein fjerning Metoder ved Blanche Intakte Planter eller ved varmebehandling av ekstrakter

Summary

Tre varme utfellingsmetoder er presentert som effektivt fjerner mer enn 90% av vertscelleproteiner (HCPs) fra tobakksekstrakter før en hvilken som helst annen rensetrinn. Anlegget HCPs irreversibelt å aggregere ved temperaturer over 60 ° C.

Abstract

Planter gir ikke bare mat, fôr og råvarer for mennesker, men har også blitt utviklet som et økonomisk produksjonssystem for biofarmasøytisk proteiner, slik som antistoffer, vaksinekandidater og enzymer. Disse må renses fra plantebiomasse men kromatografiske trinn blir hindret av de høye konsentrasjonene av vertscelleproteiner (HCPs) i planteekstrakter. Men de fleste HCPs irreversibelt å aggregere ved temperaturer over 60 ° C som letter etterfølgende rensing av målproteinet. Her er tre metoder presenteres for å oppnå varme utfelling av tobakk Helsepersonell i enten intakte blader eller ekstrakter. Blanche av intakte bladene kan enkelt bli innlemmet i eksisterende prosesser, men kan ha en negativ innvirkning på etterfølgende filtreringstrinn. Det motsatte er tilfelle for varme utfelling av blad ekstrakter i en rørt fartøy, som kan forbedre ytelsen til nedstrømsvirksomheten riktignok med store endringer i prosessutstyr design, for eksempelhomogenisator geometri. Til slutt blir en varmeveksler oppsett godt karakterisert med hensyn til varmeoverføringsbetingelser og lett å skala, men rengjøring kan være vanskelig og det kan være en negativ innvirkning på filterkapasitet. Utformingen-of-eksperimenter tilnærming kan brukes til å identifisere de mest relevante prosessparametre som påvirker HCP fjerning og produktgjenvinning. Dette letter anvendelsen av hver metode i andre uttrykk plattformer og identifisering av den mest egnede metode for et gitt rensestrategi.

Introduction

Moderne helsevesen stadig avhenge biofarmasøytisk proteiner ^1. Fremstilling av disse proteiner i planter er fordelaktig på grunn av den lave patogen byrde og større skalerbarhet forhold til konvensjonelle ekspresjonssystemer ^2-4. Imidlertid kan nedstrømsprosessering (DSP) av plante-avledet legemidler være utfordrende fordi forstyrrende ekstraksjonsmetoder resultere i en høy partikkel belastning, med turbidities stiger 5000 nefelometriske turbiditetsenheter (NTUs), og vertscelleprotein (HCP) konsentrasjoner ofte overstiger 95 % [m / m] ^5,6.

Forseggjort avklarings prosedyrer er nødvendig for å fjerne dispergerte partikler ^7-9, men kromatografi utstyr er mindre kostbart å operere i binde-og-elute modus under innledende produktgjenvinningen hvis det er et tidligere trinn for effektiv fjerning av HCPs ^10,11. Dette kan oppnås enten ved utfelling av målproteinet ved hjelp flocculmaur ¹² eller lav pH ^13,14, samt ved forårsaker Helsepersonell å aggregere. Den selektive aggregering av ribulose-1,5-bisfosfat-karboksylase / oksygenase (RUBISCO), det mest tallrike HCP i grønne planter som tobakk (Nicotiana tabacum) kan fremmes ved tilsetning av polyetylenglykol ^15, men dette er kostbart og uforenlig med stor -skala produksjon. Varmebehandling har vist seg å denaturere og presipitere mer enn 95% av tobakks HCPs, mens protein malaria vaksinekandidater som Vax8 forbli stabil i oppløsning ^16-18.

Tre forskjellige metoder ble brukt for å oppnå den varmeinduserte utfelling av tobakks HCPs: (i) blanchering, dvs. nedsenking av intakte blader i varm væske, (ii) en temperaturkontrollert omrørt beholder, og (iii) en varmeveksler ( Figur 1) ^16. For intakte blader, forvelling oppnås rask og effektiv utfelling av Helsepersonell og var også lettå skalere opp og kompatibel med eksisterende storskala produksjonsprosesser som inkluderer et første skritt for å vaske anlegget biomasse ^19. I motsetning til dette temperaturstyrt fartøy er allerede tilgjengelig i noen prosesser og kan anvendes for varmebehandling av plante-ekstrakter ^20, men deres skalerbarhet og energioverføring hastighet er begrenset, fordi den overflate-til-volum-forholdet av tankene er gradvis redusert og blir uegnet i prosessen skala. En varmeveksler er en teknisk veldefinert alternativ til å varmes opp omrørt fartøy, men krever en rikelig tilførsel av varme- og kjølemedier, for eksempel damp og kaldt vann, samt en kontrollert volumetrisk strømningshastighet som er tilpasset til varmeveksleren geometri og media egenskaper, f.eks., den spesifikke varmekapasitet. Denne artikkelen viser hvordan alle tre fremgangsmåter kan anvendes for varmeinduserte utfelling av tobakk HCPs, og plante HCPs generelt. Etablering og drift av EACh fremgangsmåte i et laboratorium kan brukes til å vurdere om de er egnet for større skala prosesser. Den store utfordringen er å identifisere tilstrekkelig skala-down modeller og driftsforhold for hver operasjon som ligner enhetene og betingelsene som brukes under prosessen-skala produksjon. Dataene presentert her viser til eksperimenter utført med transgene tobakksplanter som uttrykker det malaria vaksine kandidat Vax8 og fluorescerende protein DsRed ^16, men fremgangsmåten er også blitt brukt til N. benthamiana planter forbigående uttrykker andre biofarmasøytisk proteiner ^21.

En design-of-eksperimenter (DoE) nærmer ²² kan forenkle prosessutvikling, og flokulanter ²³ kan også være nyttig i denne sammenheng som tidligere beskrevet ^åtte. Hovedforskjellen mellom blanche, oppvarmede beholdere og varmevekslere er at blanche påtrykkes intakte bladene tidlig i prosessen, mens othennes tilføres planteekstrakter (figur 1).

Figur 1:. Process Flow skjema som illustrerer gjennomføring av tre ulike metoder for Tobacco HCP Heat Nedbør Plantematerialet blir vasket og homogenisert før avklaring og rensing. Utstyr for forvellingstrinn (rød) lett kan legges til eksisterende maskineri. I motsetning til ved hjelp av en rørt fartøy (oransje) og spesielt en varmeveksler (blå) krever en eller flere andre enheter og rør. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. dyrke tobakksplanter Spyle hver mineralullblokk med 1 til 2 l avionisert vann og deretter med 1 liter 0,1% [w / v] gjødsel-løsning. Plasser en tobakk frø i hver mineralull blokk og forsiktig flush med 0,25 liter gjødsel løsning uten å vaske bort frø 16. Dyrke tobakksplanter i 7 uker i et veksthus med 70% relativ fuktighet, en 16 timers fotoperiode (180 umol sek – 1 m – 2; λ = 400-700 nm) og en 25/22 ° C lys / mørke temperaturregime….

Representative Results

Heat utfelling av tobakk vertscelleproteiner forvelling Blancheringsfremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2 ble med hell anvendt for å utfelle HCPs fra tobakksblader med 70 ° C, noe som reduserer TSP ved 96 ± 1% (n = 3), mens utvinning av opptil 51% av den Vax8 målproteinet, og dermed øke dens renhet fra 0,1% til 1,2% før kromatografisk separasjon 16. Det var også mulig å utvinne 83 ± 1% (n = 3) av det fluorescerende protein DsRed, øker dens renhet fra …

Discussion

De tre metoder for varme nedbør beskrevet ovenfor effektivt kan fjerne tobakk Helsepersonell før noen kromatografisk rensetrinn ^16,17. De utfyller andre strategier som tar sikte på å øke første produktet renhet, f.eks guttation ^29, rhizosecretion ³⁰ eller sentrifugal utvinning ^31,32, som alle er begrenset til utskilte proteiner. Imidlertid kan de varmebaserte metoder bare brukes på en meningsfull måte dersom målet proteinet som skal renses kan tåle den minst…

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Autoclaving basket	Nalgene	6917-0230	Basket for leaf blanching
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM	Sequip	n.a.	Particle size analyzer
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
CM5 chip	GE Healthcare	BR100012	Chip for SPR measurements
Cuvette 10x10x45	Sarsted	67.754	Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)	n.a. (custom design)	n.a.	Heat exchanger
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K200P 60D	Pall	5302303	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Water bath thermostat
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 specific antibody
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Sodium disulfit	Carl Roth GmbH	8554.1	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm	n.a. (custom design)	n.a.	Container for heat precipitation
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.	Software to operate the Zetasizer Nano ZS device