Comparación de los métodos de tabaco Protein Removal célula huésped mediante escaldado plantas intactas o por tratamiento térmico de los extractos

Summary

Tres de calor se presentan métodos de precipitación que elimina de manera efectiva más de 90% de las proteínas de la célula huésped (HCP) de tabaco extrae antes de cualquier otra etapa de purificación. La planta de profesionales de la Salud irreversiblemente total a temperaturas superiores a 60 ° C.

Abstract

Las plantas no sólo proporcionan alimentos, piensos y materias primas para los seres humanos, sino que también se han desarrollado como un sistema de producción económica para las proteínas biofarmacéuticas, tales como anticuerpos, candidatas a vacunas y enzimas. Estos deben ser purificados a partir de la biomasa de la planta pero etapas de cromatografía se ven obstaculizados por las altas concentraciones de proteínas de la célula huésped (HCP) en extractos de plantas. Sin embargo, la mayoría de los profesionales de la Salud irreversiblemente agregan a temperaturas superiores a 60 ° C que facilitan la posterior purificación de la proteína diana. Aquí, tres métodos se presentan para lograr la precipitación de calor de HCP de tabaco, ya sea en hojas intactas o extractos. El blanqueo de las hojas intactas puede ser fácilmente incorporado en los procesos existentes, pero puede tener un impacto negativo en las etapas de filtración posteriores. Lo contrario es cierto para la precipitación de calor de extractos de hojas en un recipiente agitado, lo que puede mejorar el rendimiento de las operaciones aguas abajo aunque con cambios importantes en el diseño de equipos de proceso, tales comogeometría homogeneizador. Por último, una configuración de intercambiador de calor está bien caracterizado en términos de condiciones de transferencia de calor y fácil de escalar, pero la limpieza puede ser difícil y puede haber un impacto negativo en la capacidad del filtro. El enfoque de diseño de experimentos se puede utilizar para identificar los parámetros de proceso más importantes que afectan a la eliminación HCP y recuperación del producto. Esto facilita la aplicación de cada método en otras plataformas de expresión y la identificación del método más adecuado para una estrategia de purificación dado.

Introduction

Los sistemas de salud modernos dependen cada vez más de las proteínas biofarmacéuticas ^1. La producción de estas proteínas en las plantas es ventajosa debido a la baja carga de patógenos y una mayor escalabilidad en comparación con los sistemas de expresión convencionales ^2-4. Sin embargo, el procesamiento aguas abajo (DSP) de productos farmacéuticos derivados de plantas puede ser un reto debido a que los procedimientos de extracción de punta dan como resultado una alta carga de partículas, con turbidez inferior o igual a 5.000 unidades nefelométricas de turbidez (NTU), y la proteína de la célula huésped (HCP) las concentraciones menudo superior a 95 [m / m] ^5,6%.

Se requieren procedimientos de aclaración elaborados para eliminar las partículas dispersas ^7-9, pero un equipo de cromatografía es menos costoso de operar en el modo de vinculación y eluyen durante la recuperación inicial del producto si hay un paso anterior para la eliminación eficaz de los PCH ^10,11. Esto se puede lograr ya sea por precipitación de la proteína diana utilizando floccul¹² hormigas o de bajo pH ^13,14, así como haciendo que el PCH a agregarse. La agregación selectiva de ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa / oxigenasa (RuBisCO), el HCP más abundante en las plantas verdes tales como el tabaco (Nicotiana tabacum), puede promoverse mediante la adición de polietilenglicol ^15, pero esto es caro e incompatible con gran -scale de fabricación. El tratamiento térmico se ha demostrado para desnaturalizar y precipitar más del 95% de los profesionales sanitarios de tabaco, mientras que los candidatos de la vacuna de la malaria proteína tales como Vax8 permanecen estables en solución ^16-18.

Tres enfoques diferentes fueron usados ​​para lograr la precipitación inducida por calor de PCH tabaco: (i) de blanqueo, es decir, la inmersión de hojas intactas en líquido caliente, (ii) una temperatura controlada recipiente de agitación, y (iii) un intercambiador de calor ( Figura 1) ^16. Para hojas intactas, el blanqueado logrado la precipitación rápida y eficaz de los profesionales sanitarios y también fue fácilpara ampliar y compatible con los procesos de fabricación a gran escala existentes que incluyen un paso inicial para lavar la biomasa de la planta ^19. En contraste, los vasos de temperatura controlada ya están disponibles en algunos procesos y se pueden utilizar para el tratamiento térmico de los extractos de plantas ^20, pero su capacidad de ampliación y velocidad de transferencia de energía son limitados debido a que la relación de superficie a volumen de los tanques se reduce progresivamente y se convierte en no aptos a escala de proceso. Un intercambiador de calor es una alternativa técnicamente bien definido para calentar calderas de agitación, pero requiere un suministro abundante de calefacción y medios de refrigeración, por ejemplo, vapor y agua fría, así como una tasa de flujo volumétrico estrechamente controlado que se adapta a la geometría del intercambiador de calor y propiedades de medios, por ejemplo., la capacidad calorífica específica. Este artículo muestra cómo los tres métodos se pueden utilizar para la precipitación inducida por calor de HCP de tabaco, y HCP vegetales en general. El establecimiento y funcionamiento de EACmétodo h en un laboratorio puede utilizarse para evaluar su idoneidad para los procesos a mayor escala. El principal desafío es identificar modelos a escala reducida y adecuadas condiciones de funcionamiento para cada operación que se asemejan a las condiciones y dispositivos utilizados durante el proceso de fabricación a gran escala. Los datos presentados aquí se refieren a experimentos realizados con plantas de tabaco transgénicas que expresan la vacuna candidata malaria Vax8 y proteína fluorescente DsRed ^16, pero el método también se ha aplicado con éxito a N. benthamiana plantas que expresaban transitoriamente otras proteínas biofarmacéuticas ^21.

Un diseño-de-experimentos (DOE) se aproximan a ²² puede facilitar el desarrollo de procesos, y floculantes ²³ también puede ser beneficioso en este contexto como se ha descrito previamente ^8. La principal diferencia entre el escaldado, depósitos con calefacción y los intercambiadores de calor es que el escaldado se aplica a las hojas intactas al principio del proceso, mientras que el otella se aplican a extractos de plantas (Figura 1).

Figura 1:. Esquema del flujo de procesos que ilustra la implementación de tres diferentes métodos para Tabaco HCP precipitación térmica El material vegetal se lava y se homogeneiza antes de clarificación y purificación. El equipo para la etapa de blanqueo (rojo) se pueden añadir fácilmente a la maquinaria existente. Por el contrario, el uso de un recipiente agitado (naranja) y, especialmente, un intercambiador de calor (azul) requiere uno o varios dispositivos y tubos adicionales. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. Cultivar las plantas de tabaco Enjuague cada bloque de lana mineral con 1 a 2 L de agua desionizada y, posteriormente, con 1 L de 0,1% [w / v] solución de fertilizante. Coloque una semilla de tabaco en cada bloque de lana mineral y suavemente a ras de 0,25 l de solución de fertilizante sin lavarse la descendencia 16. Cultivar las plantas de tabaco durante 7 semanas en un invernadero con un 70% de humedad relativa, un fotoperíodo de 16 h (180 mmol seg – 1 m <sup…

Representative Results

Precipitación de calor de las proteínas de la célula huésped de tabaco por escaldado El procedimiento de blanqueo se describe en la sección 2. Se ha usado con éxito para precipitar los profesionales sanitarios de hojas de tabaco con 70 ° C, lo que reduce el TSP en un 96 ± 1% (n = 3), mientras se recupera hasta el 51% de la proteína diana Vax8, aumentando así su pureza a partir de 0,1% a 1,2% antes de la separación cromatográfica 16. También fue pos…

Discussion

Los tres métodos de precipitación de calor descritas anteriormente pueden eliminar eficazmente los PCH de tabaco antes de cualquier etapa de purificación cromatográfica ^16,17. Se complementan otras estrategias que tienen por objeto aumentar la pureza inicial del producto, por ejemplo, gutación ^{29, 30} o rhizosecretion centrífuga extracción de ^31,32, todas las cuales se limita a las proteínas secretadas. Sin embargo, los métodos basados ​​en el calor sólo …

Materials

2100P Portable Turbidimeter	Hach	4650000	Turbidimeter
Amine Coupling Kit	GE Healthcare	BR100050	SPR chip coupling kit
Autoclaving basket	Nalgene	6917-0230	Basket for leaf blanching
Biacore T200	GE Healthcare	28-9750-01	SPR device
Bio Cell Analyser BCA 003 R&D with 3D ORM	Sequip	n.a.	Particle size analyzer
Blender	Waring	800EG	Blender
BP-410	Furh	2632410001	Bag filter
Centrifuge 5415D	Eppendorf	5424 000.410	Centrifuge
Centrifuge tube 15 mL	Labomedic	2017106	Reaction tube
Centrifuge tube 50 mL self-standing	Labomedic	1110504	Reaction tube
CM5 chip	GE Healthcare	BR100012	Chip for SPR measurements
Cuvette 10x10x45	Sarsted	67.754	Cuvette for Zetasizer Nano ZS
Design-Expert(R) 8	Stat-Ease, Inc.	n.a.	DoE software
Disodium phosphate	Carl Roth GmbH	4984.3	Media component
Ferty 2 Mega	Kammlott	5.220072	Fertilizer
Forma -86C ULT freezer	ThermoFisher	88400	Freezer
Greenhouse	n.a.	n.a.	For plant cultivation
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm	Grodan	102446	Rockwool block
Twentey-loop heat exchanger (4.8 m length)	n.a. (custom design)	n.a.	Heat exchanger
HEPES	Carl Roth GmbH	9105.3	Media component
K200P 60D	Pall	5302303	Depth filter layer
KS50P 60D	Pall	B12486	Depth filter layer
Lauda E300	Lauda Dr Wobser GmbH	Z90010	Water bath thermostat
L/S 24	Masterflex	SN-06508-24	Tubing
mAb 5.2	American Type Culture Collection	HB-9148	Vax8 specific antibody
Masterflex L/S	Masterflex	HV-77921-75	Peristaltic pump
Miracloth	Labomedic	475855-1R	Filter cloth
MultiLine Multi 3410 IDS	WTW	WTW_2020	pH meter / conductivity meter
Osram cool white 36 W	Osram	4930440	Light source
Phytotron	Ilka Zell	n.a.	For plant cultivation
Sodium disulfit	Carl Roth GmbH	8554.1	Media component
Sodium chloride	Carl Roth GmbH	P029.2	Media component
Stainless-steel vessel; 0.7-kg 2.0-L; height 180 mm; diameter 120 mm	n.a. (custom design)	n.a.	Container for heat precipitation
Synergy HT	BioTek	SIAFRT	Fluorescence and spectrometric plate reader
VelaPad 60	Pall	VP60G03KNH4	Filter housing
Zetasizer Nano ZS	Malvern	ZEN3600	DLS particle size distribution measurement
Zetasizer Software v7.11	Malvern	n.a.	Software to operate the Zetasizer Nano ZS device