Comparación de tres diferentes métodos para determinar la proliferación celular en líneas celulares de cáncer de mama
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
El gen supresor de tumor, p53, es un regulador esencial de una serie de procesos celulares, incluyendo la detención del ciclo celular, la apoptosis y senescencia 1. Es responsable de mantener la estabilidad genómica, y por lo tanto es crucial para mantener el equilibrio de la muerte celular y el crecimiento celular. Las mutaciones en p53 son comunes en el cáncer y son la causa principal de la inactivación de p53 conduce a la proliferación de células de cáncer no controlado 2. Curiosamente, las mutaciones en p53 sólo representan aproximadamente el 25% de los cánceres de mama 3, lo que sugiere que otros mecanismos son responsables de la pérdida de la función p53. Las isoformas de p53 recientemente descubiertos se ha demostrado que se sobreexpresa en un número de cánceres humanos, y pueden modular la función de p53 de 4,5. Hemos demostrado anteriormente que la isoforma p53, Δ40p53, es la isoforma más altamente expresado en el cáncer de mama, y se regula positivamente de manera significativa en las células de cáncer de mama, en comparación con TISS normal adyacenteue 6. A raíz de esto, estable transduced la línea celular de cáncer de mama humano MCF-7 para sobreexpresar Δ40p53 utilizando el Lego-ig2-puro + vectorial (GFP +) 7. Estas células se usaron para investigar si la expresión de alto Δ40p53 aumenta las tasas de proliferación celular en células de cáncer de mama.
Hay muchos métodos directos e indirectos de la medición de la proliferación celular de las células cultivadas in vitro 8,9. Estos se pueden realizar ya sea como mediciones continuas en el tiempo, o ensayos de punto final como 10. Los métodos convencionales son todavía útiles, tales como el recuento de células usando un hemocitómetro. Este ensayo es un bajo costo y medida directa del número de células, pero no se basan en el recuento de células grandes y la formación altamente especializada para minimizar el error y gran estándar desviaciones de los recuentos. La necesidad de realizar mediciones compatible con los formatos de alto rendimiento ha llevado al desarrollo de ensayos de múltiples pocillos de placa. Estos ensayos basados en luminiscencia Measure el número de células sobre la base de una señal luminiscente que es proporcional a la actividad metabólica de la célula 11,12. Más recientemente, la introducción de las plataformas de imágenes de alta contenido ha permitido nuevas herramientas que controlan la proliferación celular mientras que proporciona la recogida de datos fenotípica cuantitativa y cualitativa, e incluye una variedad de sistemas 13. Todos estos métodos proporcionan vías para medir el crecimiento celular, ya sea por medio de ensayos de medición o de punto final continuas, y cada uno posee una serie de ventajas y desventajas con respecto a la sensibilidad, el rendimiento de los números de muestra, y la información de células, todo lo cual puede ser pesada en consecuencia dependiendo en la pregunta de investigación.
Este protocolo describe tres métodos diferentes para medir la proliferación celular in vitro, con cada método de utilización de diferentes gamas de sensibilidad, reproducibilidad y formatos de placas de múltiples pocillos. Este protocolo tiene como objetivo comparar el uso de una cha conteo de hemocitómetromber, un ensayo basado en luminiscencia viabilidad celular, y de imágenes de células, en la medición de la proliferación de células durante un tiempo de 96 horas. Para ello, el crecimiento de las células transducidas por vectores (MCF-7-LEGO) se comparó con células transducidas para sobreexpresar Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), utilizando tres diferentes densidades de células. La proliferación celular se midió cada 24 horas para un máximo de 96 hr. Se encontró que cada método para tener sus propias ventajas y desventajas, y en función del objetivo del experimento, cada uno todavía es un método valioso para proporcionar información sobre la tasa de proliferación.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo se examinaron tres métodos diferentes de medir la proliferación celular en células cultivadas. Cada método era capaz de mediciones reproducibles y precisos de la proliferación celular en 96 horas, y los resultados fueron comparables entre cada uno de los métodos de prueba (Figura 2 y 3). Tanto el ensayo basado en luminiscencia y el método de formación de imágenes de células producen los resultados más robustos, mostrando aumentos lineales en la proliferación celular despué…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
Riferimenti
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
