Vergelijking van de drie verschillende methoden voor het bepalen van de cel proliferatie in borstkanker cellijnen
Summary
This protocol describes the use of three different methods for analyzing cell proliferation in breast cancer cell lines. This includes the use of conventional cell counting, luminescence-based cell viability, and cell counting through the use of a cell imager. Each offers advantages for the reproducible measurement of cell proliferation.
Abstract
Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility with high-throughput formatting. This protocol describes the use of three different methods for measuring cell proliferation in vitro including conventional hemocytometer counting chamber, a luminescence-based assay that utilizes the change in the metabolic activity of viable cells as a measure of the relative number of cells, and a multi-mode cell imager that measures cell number using a counting algorithm. Each method presents its own advantages and disadvantages for the measurement of cell proliferation, including time, cost and high-throughput compatibility. This protocol demonstrates that each method could accurately measure cell proliferation over time, and was sensitive to detect growth at differing cellular densities. Additionally, measurement of cell proliferation using a cell imager was able to provide further information such as morphology, confluence and allowed for a continual monitoring of cell proliferation over time. In conclusion, each method is capable of measuring cell proliferation, but the chosen method is user-dependent.
Introduction
Het tumor suppressor gen p53, een essentiële regulator van een aantal cellulaire processen zoals celcyclus, apoptose en senescentie 1. Het is verantwoordelijk voor genomische stabiliteit en is daarom cruciaal voor het handhaven van het evenwicht van celdood en celgroei. Mutaties in p53 komen vaak bij kanker en de belangrijkste oorzaak van p53 inactivering leidt tot ongecontroleerde celproliferatie kanker 2. Interessant mutaties in p53 vertegenwoordigen slechts ongeveer 25% van de borstkankers 3, wat suggereert dat andere mechanismen verantwoordelijk voor het verlies van p53 functie. De recent ontdekte p53 isovormen is aangetoond dat overexpressie in een aantal menselijke kankers, en kan p53 functie 4,5 moduleren. We hebben eerder aangetoond dat het p53-isovorm, Δ40p53, is het hoogst tot expressie isovorm bij borstkanker en aanzienlijk opgereguleerd in borstkankercellen, in vergelijking met normale aangrenzende tissue 6. Naar aanleiding van dit, we stabiel getransduceerde menselijke borstkanker cellijn MCF-7 tot Δ40p53 overexpressie met behulp van de LEGO-IG2-puro + vector (GFP +) 7. Deze cellen werden gebruikt om te onderzoeken of hoge Δ40p53 expressie verhoogt celproliferatie aanbiedingen in borstkankercellen.
Er zijn vele directe en indirecte methoden voor het meten van celproliferatie in vitro gekweekte cellen 8,9. Deze kan worden uitgevoerd als continue metingen in de tijd, of eindpunt assays 10. Gebruikelijke werkwijzen zijn nog steeds bruikbaar, zoals celtellingen behulp van een hemocytometer. Deze test is een lage kosten en directe meting van het aantal cellen, maar het vertrouwen op de grote cellen en hoogopgeleide training om fouten en grote standaard afwijkingen van de tellingen te minimaliseren. De noodzaak om metingen geschikt is voor high-throughput formaten voeren heeft geleid tot de ontwikkeling van multiwell-plaat assays. Deze luminescentie-gebaseerde testen measure aantal cellen op basis van een luminescent signaal dat evenredig is met de metabolische activiteit van de cel 11,12. Meer recent, de invoering van hoge gehalte imaging platforms heeft het mogelijk gemaakt voor nieuwe instrumenten die celdeling controleren, terwijl het verstrekken van kwantitatieve en kwalitatieve verzamelen fenotypische data, en omvat een verscheidenheid aan systemen 13. Al deze werkwijzen wegen om celgroei te meten, hetzij door continue meting of eindpunt assays, en bezitten elk een reeks voordelen en nadelen met betrekking tot gevoeligheid, doorvoer van aantallen monsters en celinformatie, die derhalve afhankelijk kan worden gewogen op de onderzoeksvraag.
Dit protocol beschrijft drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in vitro, waarbij elke methode waarbij verschillende reeksen van gevoeligheid, reproduceerbaarheid en multi-well plaat formaat. Dit protocol doel belang het gebruik van een hemocytometer geteld chamber, een op luminescentie gebaseerde assay cellevensvatbaarheid en mobiele imager, bij de meting van celproliferatie gedurende een tijdsverloop van 96 uur. Hiervoor is de groei van vector-getransduceerde cellen (MCF-7-LEGO) vergeleken met cellen getransduceerd tot overexpressie Δ40p53 (MCF-7-Δ40p53), met behulp van drie verschillende celdichtheden. Celproliferatie werd gemeten elke 24 uur tot 96 uur. Elke methode bleek zijn eigen voor- en nadelen, en afhankelijk van het doel van het experiment, elk nog een waardevolle werkwijze voor het verschaffen van informatie over de snelheid van proliferatie.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit protocol werden drie verschillende methoden voor het meten van celproliferatie in gekweekte cellen onderzocht. Elke methode kon reproduceerbare en nauwkeurige metingen van celproliferatie dan 96 uur en de resultaten waren vergelijkbaar tussen elk van de geteste methoden (figuur 2 en 3). Zowel de luminescentie-gebaseerde test en cell imaging methode produceerde de meest robuuste resultaten tonen lineaire toename in celproliferatie na 96 uur (figuur 2b, c). Bovendi…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr Hamish Campbell and Prof Antony Braithwaite for their help in developing the transduced MCF-7-LeGO cell lines. We would like to acknowledge our funding support by the Bloomfield Group Foundation through the Hunter Medical Research Institute. B.C.M is supported by an APA scholarship through the University of Newcastle and the MM Sawyer Scholarship through the Hunter Medical Research Institute.
Materials
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, no phenol-red | ThermoFisher Scientific | 21063-045 | Supplemented with 10% FBS, 200mM L-glutamine, 2µg/ml insulin and 1µg/ml puromycin |
| L-glutamine solution (100x) | ThermoFisher Scientific | 25030-081 | |
| Insulin solution human | Sigma-Aldrich | I9278-5ML | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Bovogen Biologicals | SFBS-F-500ml | |
| Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P9620-10ML | |
| 0.5% trypsin-EDTA solution (10x) | ThermoFisher Scientific | 15400-054 | Dilute to 2x in DPBS |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) (1x) | ThermoFisher Scientific | 30028-02 | |
| Tissue culture flask, 75cm2 growth area | Greiner Bio-One | 658175 | |
| Scepter 2.0 Cell Counter | Merck Millipore | Automated cell counter | |
| 96 well multiwell plate, flat bottom | Nunc | 167008 | |
| Improved Neubauer Hemocytometer | BOECO Germany | BOE 01 | |
| Olympus IX51 inverted microscope | Olympus | IX51 | |
| CellTiter-Glo 2.0 Assay | Promega | G9242 | Luminescence-based assay |
| Cytation 3 Cell Imaging Multi-Mode Reader | BioTek | Plate reader for luminescence, fluorescence and brightfield cell imaging | |
| Gen5 Data Analysis Software | BioTek | GEN5 |
Riferimenti
- Lane, D. P. Cancer. p53, guardian of the genome. Nature. 358 (6381), 15-16 (1992).
- Olivier, M., Hollstein, M., Hainaut, P. TP53 mutations in human cancers: origins, consequences, and clinical use. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (1), a001008 (2010).
- Olivier, M., et al. The clinical value of somatic TP53 gene mutations in 1,794 patients with breast cancer. Clin Cancer Res. 12 (4), 1157-1167 (2006).
- Bourdon, J. C., et al. p53 isoforms can regulate p53 transcriptional activity. Genes Dev. 19 (18), 2122-2137 (2005).
- Avery-Kiejda, K. A., et al. Small molecular weight variants of p53 are expressed in human melanoma cells and are induced by the DNA-damaging agent cisplatin. Clin Cancer Res. 14 (6), 1659-1668 (2008).
- Avery-Kiejda, K. A., Morten, B., Wong-Brown, M. W., Mathe, A., Scott, R. J. The relative mRNA expression of p53 isoforms in breast cancer is associated with clinical features and outcome. Carcinogenesis. 35 (3), 586-596 (2014).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral "gene ontology" (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16 (4), 698-706 (2008).
- Riss, T. L., Moravec, R. A., Celis, J. E. . Cell Biology. , 25-31 (2006).
- Ng, K. W., Leong, D. T., Hutmacher, D. W. The challenge to measure cell proliferation in two and three dimensions. Tissue Eng. 11 (1-2), 182-191 (2005).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev Technol. 2 (1), 51-62 (2004).
- Butzler, M., Worzella, T., Hungriano, M., Osorio, F., Hanegraaff, I., Cowan, C. . Automated cytotoxicity profiling using the CyBi-FeliX instrument, cell health assays and thaw-and-use cells. , (2014).
- . . CellTiter-Glo 2.0 Assay Technical Manual #403. , (2015).
- Banks, P., Brescia, P. J. . Application Guide: Automated Digital Microscopy. , (2015).
- Bastidas, O. . Cell Counting with Neubauer Chamber: Basic Hemocytometer Usage. , (2016).
- Bastidas, O. . , (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R., Niles, A. L., Sittampalam, G. S., Coussens, N. P., Nelson, H. Cell Viability Assays. Assay Guidance Manual[Internet]. , (2013).
- Quent, V. M., Loessner, D., Friis, T., Reichert, J. C., Hutmacher, D. W. Discrepancies between metabolic activity and DNA content as tool to assess cell proliferation in cancer research. J Cell Mol Med. 14 (4), 1003-1013 (2010).
- Crane, J., Mittar, D., Soni, D., McIntyre, C. . Cell Cycle Analysis Using the BD BrdU FITC Assay on the BD FACSVerse System. , 1-12 (2011).
