Neuronala kulturer är en bra modell för att studera nya hjärnstimuleringstekniker via deras effekt på enskilda nervceller eller en population av nervceller. Presenteras här finns olika metoder för stimulering av mönstrade neuronala kulturer från ett elektriskt fält produceras direkt av bad elektroder eller framkallas av ett tidsvarierande magnetfält.
En neuron kommer att skjuta en aktionspotential när dess membranpotential överskrider en viss tröskel. I typiska aktiviteten i hjärnan, sker detta som ett resultat av kemiska insignaler till dess synapser. Emellertid kan nervceller också upphetsad av en påtvingad elektriskt fält. I synnerhet, nya kliniska tillämpningar aktivera neuroner genom att skapa ett elektriskt fält externt. Det är därför av intresse att undersöka hur neuron reagerar på det yttre fältet och vad som orsakar aktionspotentialen. Lyckligtvis är möjlig precis och kontrollerad applicering av ett externt elektriskt fält för embryonala neuronala celler som är utskurna, dissocierade och odlade i kulturer. Detta gör det möjligt att undersöka dessa frågor i en mycket reproducerbar system.
I detta dokument några av de tekniker som används för kontrollerad tillämpning av externt elektriskt fält på neuronala kulturer granskas. Nätverken kan vara antingen endimensionell, dvs mönstrad i linear former eller tillåts växa på hela substratets plan, och därmed tvådimensionell. Vidare kan excitationen skapas genom direkt applicering av elektriskt fält via elektroder nedsänkta i fluid (bad elektroder) eller genom att inducera det elektriska fältet med hjälp av fjärrkontrollen skapandet av magnetiska pulser.
Interaktionen mellan neuroner och externa elektriska fält har grundläggande konsekvenser såväl som praktiska. Medan det är känt sedan tiden för Volta att ett externt applicerat elektriskt fält kan excitera vävnad, de mekanismer som ansvarar för produktionen av en resulterande verkningspotential i nervceller är först nyligen börjat redas ut en, två, tre, fyra. Detta inkluderar att hitta svar på frågor avseende den mekanism som orsakar depolarisation av membranpotentialen, rollen av membranegenskaper och jonkanaler, och även den region i neuron som svarar på det elektriska fältet 2, 5. Terapeutisk neurostimulering 6, 7, 8, 9, <sup10 metoder är särskilt beroende av denna information, vilket kan vara avgörande för att rikta in de drabbade områdena och för att förstå resultatet av behandlingen. Sådan förståelse kan också bidra till att utveckla behandlingsprotokoll och nya metoder för stimulering av olika områden i hjärnan.
Att mäta interaktionen inom hjärnan in vivo lägger till en viktig komponent för denna förståelse, men hindras av oriktigheten och låg kontrollbarhet av mätningar i skallen. Däremot kan mätningar i kulturer enkelt utföras i hög volym med hög precision, utmärkt signal till brusprestanda och hög grad av reproducerbarhet och kontroll. Med hjälp av kulturer kan en stor variation av neuronala egenskaper hos kollektiva nätverksbeteenden belysas 11 , 12 , 13 , 14 , </sup> 15 , 16 . På liknande sätt förväntas detta välkontrollerade system vara mycket effektivt för att belysa mekanismen med vilken andra stimuleringsmetoder fungerar, till exempel hur kanalöppning under optisk stimulering i optogenetiskt aktiva neuroner 17 , 18 , 19 är ansvarig för att skapa åtgärdspotential.
Här ligger fokus på att beskriva utveckling och förståelse av verktyg som effektivt kan excitera neuron via ett externt elektriskt fält. I detta dokument beskriver vi förberedelsen av tvådimensionella och endimensionella mönstrade hippocampala kulturer, stimulering med användning av olika konfigurationer och orientering av ett direkt applicerat elektriskt fält av badelektroder och slutligen stimulering av tvådimensionella och mönstrade endimensionella kulturer av en Tidsvarierande magnetfält, vilket inducerar ett elektriskt fält5, 20, 21.
1D patterning är ett viktigt verktyg som kan användas för en mängd olika applikationer. Till exempel har vi använt 1D-patrering för att skapa logiska grindar från neuronkulturer 29 och mer nyligen för att mäta Chronaxie och Rheobase av råttahippocampala neuroner 5 och sänkning av signalutbredningshastigheten för avfyrningsaktivitet i Downs syndrom hippokampala neuroner jämfört med Vildtyp (WT) hippocampala neuroner 27 . Det föreslagna…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar Ofer Feinerman, Fred Wolf, Menahem Segal, Andreas Neef och Eitan Reuveny för mycket hjälpsamma diskussioner. Författarna tackar Ilan Breskin och Jordi Soriano för att utveckla tidiga versioner av tekniken. Författarna tackar Tsvi Tlusty och Jean-Pierre Eckmann för att få hjälp med de teoretiska begrepp. Denna forskning stöddes av Stiftelsen Minerva, ministeriet för vetenskap och teknik, Israel, och Israel Science Foundation 1320-1309 och Bi-National Science Foundation 2.008.331.
APV | Sigma-Aldrich | A8054 | Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2 |
B27 supp | Gibco | 17504-044 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
bicuculline | Sigma-Aldrich | 14343 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
Borax (sodium tetraborate decahydrate) | Sigma-Aldrich | S9640 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
Boric acid | Frutarom LTD | 5550710 | Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2 |
CaCl2 , 1M | Fluka | 21098 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
CNQX | Sigma-Aldrich | C239 | Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2 |
COMSOL | COMSOL Inc | Multiphysics 3.5 | Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2 |
D-(+)-Glucose, 1M | Sigma-Aldrich | 65146 | Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1 1.5.2 |
D-PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
FCS(FBS) | Gibco | 12657-029 | Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
Fibronectin | Sigma-Aldrich | F1141 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
Fluo4, AM | Life technologies | F14201 | Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1 1.5.3 1.5.5 |
FUDR | Sigma-Aldrich | F0503 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
Gentamycin | Sigma-Aldrich | G1272 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
GlutaMAX 100X | Gibco | 35050-038 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 |
Hepes, 1M | Sigma-Aldrich | H0887 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
HI HS | BI | 04-124-1A | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1 1.4.1 1.4.2 |
KCl, 3M | Merck | 1049361000 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6 |
MEM x 1 | Gibco | 21090-022 | Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1 1.4.2 |
MgCl2 , 1M | Sigma-Aldrich | M1028 | Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2 |
NaCl, 4M | Bio-Lab | 19030591 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
Octadecanethiol | Sigma-Aldrich | 01858 | Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3 |
Pluracare F108 NF Prill | BASF Corparation | 50475278 | Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4 1.2.6 |
Poly-L-lysine 0.01% solution | Sigma-Aldrich | P47075 | Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4 |
Sucrose, 1M | Sigma-Aldrich | S1888 | Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2 |
Thiol | Sigma-Aldrich | 1858 | Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3 |
URIDINE | Sigma-Aldrich | U3750 | Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1 |
Sputtering machine | AJA International, Inc | ATC Orion-5Series | coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2 |
Pen plotter | Hewlett Packard | HP 7475A | Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5 |
Electrodes wires | A-M Systems, Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 2.2 2.3 2.4.5 |
Signal generator | BKPrecision | 4079 | Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3 |
Amplifier | Homemade | Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3 | |
Power supply | Matrix | MPS-3005 LK-3 | Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3 |
Transcranial magnetic stimulation | Magstim, Spring Gardens, UK | Rapid 2 | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1 3.3 3.4 |
Epoxy | Cognis | Versamid 140 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
Epoxy | Shell | EPON 815 | Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4 |
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems, | Carlsborg WA | 767000 | Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1 |
Circular magnetic coil | Homemade | Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3 | |
WaveXpress SW | B&K Precision | Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32 | |
Xion Ultra 897 | Andor | Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4 |