Extern Excite av nervceller Använda elektriska och magnetiska fält i en-och två-dimensionella kulturer

Summary

Neuronala kulturer är en bra modell för att studera nya hjärnstimuleringstekniker via deras effekt på enskilda nervceller eller en population av nervceller. Presenteras här finns olika metoder för stimulering av mönstrade neuronala kulturer från ett elektriskt fält produceras direkt av bad elektroder eller framkallas av ett tidsvarierande magnetfält.

Abstract

En neuron kommer att skjuta en aktionspotential när dess membranpotential överskrider en viss tröskel. I typiska aktiviteten i hjärnan, sker detta som ett resultat av kemiska insignaler till dess synapser. Emellertid kan nervceller också upphetsad av en påtvingad elektriskt fält. I synnerhet, nya kliniska tillämpningar aktivera neuroner genom att skapa ett elektriskt fält externt. Det är därför av intresse att undersöka hur neuron reagerar på det yttre fältet och vad som orsakar aktionspotentialen. Lyckligtvis är möjlig precis och kontrollerad applicering av ett externt elektriskt fält för embryonala neuronala celler som är utskurna, dissocierade och odlade i kulturer. Detta gör det möjligt att undersöka dessa frågor i en mycket reproducerbar system.

I detta dokument några av de tekniker som används för kontrollerad tillämpning av externt elektriskt fält på neuronala kulturer granskas. Nätverken kan vara antingen endimensionell, dvs mönstrad i linear former eller tillåts växa på hela substratets plan, och därmed tvådimensionell. Vidare kan excitationen skapas genom direkt applicering av elektriskt fält via elektroder nedsänkta i fluid (bad elektroder) eller genom att inducera det elektriska fältet med hjälp av fjärrkontrollen skapandet av magnetiska pulser.

Introduction

Interaktionen mellan neuroner och externa elektriska fält har grundläggande konsekvenser såväl som praktiska. Medan det är känt sedan tiden för Volta att ett externt applicerat elektriskt fält kan excitera vävnad, de mekanismer som ansvarar för produktionen av en resulterande verkningspotential i nervceller är först nyligen börjat redas ut ^{en, två, tre, fyra.} Detta inkluderar att hitta svar på frågor avseende den mekanism som orsakar depolarisation av membranpotentialen, rollen av membranegenskaper och jonkanaler, och även den region i neuron som svarar på det elektriska fältet ^{2, 5.} Terapeutisk neurostimulering ^{6, 7, 8, 9,} <sup10 metoder är särskilt beroende av denna information, vilket kan vara avgörande för att rikta in de drabbade områdena och för att förstå resultatet av behandlingen. Sådan förståelse kan också bidra till att utveckla behandlingsprotokoll och nya metoder för stimulering av olika områden i hjärnan.

Att mäta interaktionen inom hjärnan in vivo lägger till en viktig komponent för denna förståelse, men hindras av oriktigheten och låg kontrollbarhet av mätningar i skallen. Däremot kan mätningar i kulturer enkelt utföras i hög volym med hög precision, utmärkt signal till brusprestanda och hög grad av reproducerbarhet och kontroll. Med hjälp av kulturer kan en stor variation av neuronala egenskaper hos kollektiva nätverksbeteenden belysas ^{11 , 12 , 13 , 14 ,} </sup> ^{15 , 16} . På liknande sätt förväntas detta välkontrollerade system vara mycket effektivt för att belysa mekanismen med vilken andra stimuleringsmetoder fungerar, till exempel hur kanalöppning under optisk stimulering i optogenetiskt aktiva neuroner ^{17 , 18 , 19} är ansvarig för att skapa åtgärdspotential.

Här ligger fokus på att beskriva utveckling och förståelse av verktyg som effektivt kan excitera neuron via ett externt elektriskt fält. I detta dokument beskriver vi förberedelsen av tvådimensionella och endimensionella mönstrade hippocampala kulturer, stimulering med användning av olika konfigurationer och orientering av ett direkt applicerat elektriskt fält av badelektroder och slutligen stimulering av tvådimensionella och mönstrade endimensionella kulturer av en Tidsvarierande magnetfält, vilket inducerar ett elektriskt fält^{5, 20, 21.}

Protocol

Etik uttalande: Rutiner som rör djurhantering gjordes i enlighet med riktlinjerna i Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) av Weizmann Institute of Science, och lämplig israelisk lag. Weizmann Institute är ackrediterat av Föreningen för bedömning och ackreditering för laboratorie Animal Care International (AAALAC). Weizmann Institutional Animal Care och användning kommittén godkänt denna studie, som genomfördes med hippocampus nervceller. 1. Framställning av T…

Representative Results

Protokollet presenteras möjliggör enkel mönstring av neuronala kulturer. När det kombineras med flera metoder vi utvecklat för stimulering, gör det möjligt att göra mätningar av vissa inneboende neuron egenskaper såsom Chronaxie och Rheobasen 5, att jämföra egenskaperna hos friska och sjuka nervceller 27, för att hitta optimala sätt att stimulera kulturer som en funktion av deras struktur och många fler nya metoder. Nå…

Discussion

1D patterning är ett viktigt verktyg som kan användas för en mängd olika applikationer. Till exempel har vi använt 1D-patrering för att skapa logiska grindar från neuronkulturer ²⁹ och mer nyligen för att mäta Chronaxie och Rheobase av råttahippocampala neuroner ⁵ och sänkning av signalutbredningshastigheten för avfyrningsaktivitet i Downs syndrom hippokampala neuroner jämfört med Vildtyp (WT) hippocampala neuroner ²⁷ . Det föreslagna…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4