Externe Anregung von Neuronen mittels elektrische und magnetische Felder in One- und Zweidimensionale Kulturen

Summary

Neuronale Kulturen sind ein gutes Modell für die Untersuchung Schwellen Hirnstimulation Techniken über ihre Wirkung auf die einzelnen Neuronen oder einer Population von Neuronen. Dargestellt hier sind verschiedene Verfahren zur Stimulation von gemusterten neuronalen Kulturen durch ein elektrisches Feld erzeugt wird direkt durch Badelektroden oder induziert durch ein zeitlich veränderliches Magnetfeld.

Abstract

Ein Neuron wird ein Aktionspotential ausgelöst, wenn dessen Membranpotential einen bestimmten Schwellenwert überschreitet. In typischer Aktivität des Gehirns, tritt dies als Ergebnis chemischer Eingänge seine Synapsen. Allerdings Neuronen können auch durch ein auferlegtes elektrisches Feld angeregt werden. Insbesondere aktivieren bisherige klinische Anwendungen Neuronen, die durch ein elektrisches Feld von außen zu schaffen. Es ist daher von Interesse, zu untersuchen, wie das Neuron zum äußeren Feld reagiert und was bewirkt, dass das Aktionspotential. Glücklicherweise ist eine präzise und kontrollierte Anwendung eines externen elektrischen Feldes möglich ist, für die embryonale neuronale Zellen, die herausgeschnitten werden, dissoziiert und in Kulturen gezüchtet. Dies ermöglicht die Untersuchung dieser Fragen in hochreproduzierbarer System.

In diesem Papier einige der Techniken für die kontrollierte Anwendung von externem elektrischem Feld auf neuronalen Kulturen verwendet werden, überprüft. Die Netzwerke können entweder eindimensional sein, dh in linea gemustertr Formen oder auf der gesamten Ebene des Substrats wachsen gelassen, und somit zweidimensional. Darüber hinaus kann die Anregung durch das direkte Anlegen des elektrischen Feldes über die Elektroden in dem Fluid (Badelektroden) oder durch Induzieren des elektrischen Felds unter Verwendung der Fern Schaffung magnetischer Impulse erzeugt wird eingetaucht.

Introduction

Die Wechselwirkung zwischen Neuronen und externen elektrischen Feldern hat sowohl grundlegende Implikationen als auch praktische. Während es seit den Zeiten von Volta bekannt ist, dass ein extern angelegtes elektrisches Feld Gewebe anregen kann, sind die Mechanismen, die für die Produktion eines resultierenden Aktionspotentials in Neuronen verantwortlich sind, erst vor kurzem aufgefangen ^{1 , 2 , 3 , 4} . Hierbei handelt es sich um Antworten auf Fragen, die den Mechanismus betreffen, der die Depolarisation des Membranpotentials, die Rolle der Membraneigenschaften und der Ionenkanäle und sogar die Region im Neuron, die auf das elektrische Feld ^{2 , 5} reagiert, verursacht. Therapeutische Neurostimulation ^{6 , 7 , 8 , 9 ,} <supclass = „xref“> 10 Methoden sind besonders abhängig von diesen Informationen, die für die Ausrichtung der betroffenen Gebiete von entscheidenden Bedeutung sein kann und das Ergebnis der Therapie für das Verständnis. Ein solches Verständnis kann auch helfen, Behandlungsprotokolle und neue Ansätze zur Stimulation verschiedenen Bereiche im Gehirn zu entwickeln.

Messen der Wechselwirkung innerhalb des di – vivo – Gehirns fügt eine wichtige Komponente dieses Verständnisses, sondern wird durch die Ungenauigkeit und niedrige Steuerbarkeit der Messungen innerhalb des Schädels behindert. Im Gegensatz dazu können die Messungen in den Kulturen mit hohen Präzision leicht, exzellenten Signal-Rausch-Leistung und einem hohen Grad an Reproduzierbarkeit und der Kontrolle in hohem Volumen durchgeführt werden. Mit Kulturen eine große Vielfalt von neuronalen Eigenschaften des kollektiven Verhalten des Netzwerks können ¹¹ aufgeklärt ^{werden, 12, 13, 14,} </sup> ^{15, 16.} In ähnlicher Weise ist dies gut kontrolliert werden , um hocheffiziente System erwartet , dass der Mechanismus in Aufklären , durch die anderen Stimulationsverfahren arbeiten, wie zum Beispiel Kanalöffnung während der optischen Stimulation in optogenetically aktiven Neuronen ^{17, 18, 19} ist verantwortlich für die Erstellung von Aktionspotential.

Hier liegt der Schwerpunkt auf der Beschreibung der Entwicklung und das Verständnis von Werkzeugen, die effizient das Neuron über ein externes elektrisches Feld anregen kann. In diesem Papier beschreiben wir die Herstellung von zweidimensionaler und eindimensionalen gemusterten hippocampalen Kulturen, Stimulation verschiedene Konfigurationen und Orientierung eines direkt angelegten elektrischen Feld von Badelektroden verwenden und schließlich Stimulation von zweidimensionalen und bemustert eindimensionalen Kulturen nach a zeitlich veränderliches Magnetfeld, das ein elektrisches Feld induziert,^{5, 20, 21.}

Protocol

Ethikerklärung: Verfahren unter Verwendung tierische Handhabung wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) des Weizmann Institute of Science und dem entsprechenden israelischen Rechts getan. Das Weizmann Institut wird von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) akkreditiert. Das Weiz Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt diese Studie mit Hippocampus-Neuronen durchgeführt. <p class="…

Representative Results

Das dargestellte Protokoll ermöglicht eine einfache Strukturierung von neuronalen Kulturen. Wenn es mit mehreren Methoden kombiniert wird, die wir für die Stimulation entwickelt haben, ermöglicht es, Messungen von einigen intrinsischen Neuroneigenschaften wie Chronaxie und Rheobase 5 durchzuführen, um die Eigenschaften von gesunden und kranken Neuronen zu vergleichen, um optimale Wege zu finden, um Kulturen als Funktion von zu stimulieren Ihre Struktur u…

Discussion

1D Musterung ist ein wichtiges Werkzeug, das für eine Vielzahl von Anwendungen eingesetzt werden kann. Zum Beispiel haben wir 1D Musterung für die Erstellung von Logikgattern aus neuronalen Kulturen ²⁹ und in jüngerer Zeit zu messen , die Chronaxie und die Rheobase von Ratten – Hippocampus – Neuronen ^5, und die Verlangsamung der Signalausbreitungsgeschwindigkeit des Brennen Aktivität in Down – Syndrom – Hippocampus – Neuronen im Vergleich zu dem verwendeten Wildtyp (WT…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4