Ekstern Eksitasjon av nerveceller ved hjelp av elektriske og magnetiske felt i en-og to-dimensjonale kulturer

Summary

Nevrale kulturer er en god modell for å studere nye hjernestimuleringsteknikker via deres effekt på enkeltnerveceller eller en populasjon av nerveceller. Presenteres her er forskjellige metoder for stimulering av mønstrede neuronale kulturer av et elektrisk felt frembragt direkte ved badelektroder eller indusert av et tidsvarierende magnetfelt.

Abstract

En nevron vil avfyre ​​et aksjonspotensial når dens membranpotensialet overstiger en viss terskel. I typisk aktiviteten i hjernen, skjer dette som et resultat av kjemiske innganger til sine synapser. Imidlertid kan neuroner også bli eksitert av et pålagt elektrisk felt. Spesielt de siste kliniske applikasjoner aktivere nerveceller ved å skape et elektrisk felt eksternt. Det er derfor av interesse å undersøke hvordan nervecellen reagerer på ytre felt og hva som forårsaker handlingen potensial. Heldigvis er nøyaktig og kontrollert påføring av et eksternt elektrisk felt mulig for embryonale neuronale celler som er skåret ut, dissosierte og dyrket i kulturer. Dette gjør etterforskningen av disse spørsmålene i en svært reproduserbar system.

I dette papiret noen av de teknikker som brukes for styrt påføring av ytre elektrisk felt på neuronale kulturer blir gjennomgått. Nettverkene kan enten være endimensjonal, det vil si mønstret i linear former eller tillatt å vokse på hele planet til substratet, og således todimensjonale. Videre kan eksitasjon skapes ved direkte anvendelse av elektrisk felt via elektroder nedsenket i væsken (badelektroder), eller ved å indusere det elektriske feltet ved hjelp av fjern opprettelse av magnetiske pulser.

Introduction

Samspillet mellom nevroner og eksterne elektriske felt har fundamentale konsekvenser samt praktiske seg. Mens det er kjent siden tider av Volta som en ytre påført elektrisk felt kan eksitere vev, blir de mekanismer som er ansvarlig for produksjonen av en resulterende virkningspotensial i neuroner bare nylig begynt å bli avslørt ^{1, 2, 3, 4.} Dette inkluderer å finne svar på spørsmål angående den mekanisme som forårsaker depolarisering av membranpotensialet, rollen av membranegenskaper og ione-kanaler, og til og med regionen i nervecelle som reagerer på det elektriske felt ^{2, 5.} Terapeutisk nerve ^{6, 7, 8, 9,} <supclass = "ekstern referanse"> 10 metoder er spesielt avhengig av denne informasjonen, noe som kan være avgjørende for å målrette de berørte områdene, og for å forstå utfallet av terapien. En slik forståelse kan også bidra i utviklingen av behandlingsprotokoller og nye tilnærminger for stimulering av ulike områder i hjernen.

Måling av vekselvirkning inne i hjernen in vivo gir en viktig komponent til denne forståelse, men er hemmet av den unøyaktighet og lav kontrollerbarhet av målinger i kraniet. I motsetning til dette, kan målinger i kulturer enkelt bli utført i høyt volum med høy presisjon, utmerket signal til støyforhold og en høy grad av reproduserbarhet og av kontroll. Ved bruk av kulturer et stort utvalg av nevronale egenskaper for kollektive forbindelsene oppførsel kan bli belyst ^{11, 12, 13, 14,} </sup> ^{15, 16.} Tilsvarende er det godt kontrollert system forventes være svært effektiv i å belyse mekanismen ved hvilken andre stimuleringsmetoder arbeide, for eksempel hvor kanalen åpner seg under optisk stimulering i optogenetically aktive neuroner ^{17, 18, 19} er ansvarlig for å opprette aksjonspotensial.

Her fokuseres det på å beskrive utvikling og forståelse av verktøy som effektivt kan opphisse nervecellen via en ekstern elektrisk felt. I denne beskrivelsen beskriver vi fremstilling av todimensjonale og endimensjonal mønstrede hippocampal kulturer, stimulering ved hjelp av forskjellige konfigurasjoner og orientering av en direkte påtrykt elektrisk felt av badelektroder, og endelig stimulering av to-dimensjonale og mønstrede endimensjonale kulturer ved en tidsvarierende magnetisk felt som induserer en elektrisk felt^{5, 20, 21.}

Protocol

Etikk Uttalelse: Prosedyrer som involverer dyr behandling ble gjort i samsvar med retningslinjene i Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Weizmann Institute of Science, og den aktuelle israelsk lov. Weizmann Institute er akkreditert av Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC). Weizmann Institutional Animal Care og bruk komité godkjente denne studien, utført med hippocampalneuroner. 1. Fremstilling av to-dimensjonale (2D) o…

Representative Results

Protokollen present gir mulighet for enkel mønstring av neuronale kulturer. Når den kombineres med flere metoder vi utviklet for stimulering, gjør det mulig å foreta målinger av noen iboende neuron egenskaper som Chronaxie og Rheobase 5, for å sammenligne egenskapene av friske og syke neuroner 27, for å finne optimale måter å stimulere kulturer som en funksjon av sin struktur og mange flere nye tilnærminger. Noen eksempler e…

Discussion

1D mønster er et viktig verktøy som kan brukes for en rekke anvendelser. For eksempel har vi brukt 1D mønstring for å lage logiske porter fra neuronale kulturer ²⁹ og mer nylig for å måle Chronaxie og Rheobase av rotte-hippokampale neuroner ^5, og nedbremsing av signalforplantningshastigheten til avfyring aktivitet i Down syndrom hippocampalneuroner forhold til villtype (WT) hippocampalneuroner ^27. Den foreslåtte protokoll for 1D mønster er r…

Materials

APV	Sigma-Aldrich	A8054	Disconnect the network. Mentioned in Section 2.4.2
B27 supp	Gibco	17504-044	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
bicuculline	Sigma-Aldrich	14343	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
Borax (sodium tetraborate decahydrate)	Sigma-Aldrich	S9640	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
Boric acid	Frutarom LTD	5550710	Borate buffer. Mentioned in Section 1.1.2
CaCl2 , 1M	Fluka	21098	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
CNQX	Sigma-Aldrich	C239	Disconnect the network . Mentioned in Section 2.4.2
COMSOL	COMSOL Inc	Multiphysics 3.5	Numerical simulation. Mentioned in Section 3.5.2
D-(+)-Glucose, 1M	Sigma-Aldrich	65146	Plating medium, Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.1.1    1.5.2
D-PBS	Sigma-Aldrich	D8537	Cell Cultures. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
FCS(FBS)	Gibco	12657-029	Plating medium. Mentioned in Section 1.1.1
Fibronectin	Sigma-Aldrich	F1141	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
Fluo4, AM	Life technologies	F14201	Imaging of spontaneous or evoked activity . Mentioned in Section 1.5.1    1.5.3    1.5.5
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Gentamycin	Sigma-Aldrich	G1272	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
GlutaMAX 100X	Gibco	35050-038	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
HI HS	BI	04-124-1A	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.1.1    1.4.1    1.4.2
KCl,  3M	Merck	1049361000	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.6
MEM x 1	Gibco	21090-022	Plating medium, Changing medium, Final medium. Mentioned in Section 1.4.1    1.4.2
MgCl2 , 1M	Sigma-Aldrich	M1028	Extracellular recording solution. Mentioned in Section 1.5.2
NaCl, 4M	Bio-Lab	19030591	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Octadecanethiol	Sigma-Aldrich	01858	Cleaning Cr-Au coated coverslips (1D cultures). Mentioned in Section 1.2.3
Pluracare F108 NF Prill	BASF Corparation	50475278	Bio-Rejection Coating, Bio Coating. Mentioned in Section 1.2.4    1.2.6
Poly-L-lysine 0.01% solution	Sigma-Aldrich	P47075	Promote cell division. Mentioned in Section 1.1.4
Sucrose, 1M	Sigma-Aldrich	S1888	Extracellular recording solution . Mentioned in Section 1.5.2
Thiol	Sigma-Aldrich	1858	Bio-Rejection Coating. Mentioned in Section 1.2.3
URIDINE	Sigma-Aldrich	U3750	Changing medium. Mentioned in Section 1.4.1
Sputtering machine	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	coating glass with thin layers of metal. Mentioned in Section 1.2.2
Pen plotter	Hewlett Packard	HP 7475A	Etching of pattern to the coated coverslip. Mentioned in Section 1.2.5
Electrodes wires	A-M Systems, Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1    2.2    2.3   2.4.5
Signal generator	BKPrecision	4079	Shaping of the electric signal. Mentioned in Section 2.3
Amplifier	Homemade		Voltage amplification of the signal from the signal generator to the electrodes. Mentioned in Section 2.3
Power supply	Matrix	MPS-3005 LK-3	Power supply to the sputtering machine. Mentioned in Section 1.2.2.3
Transcranial magnetic stimulation	Magstim, Spring Gardens, UK	Rapid 2	Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.1   3.3   3.4
Epoxy	Cognis	Versamid 140	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Epoxy	Shell	EPON 815	Casting of homemade coils. Mentioned in Section 3.4
Platinum wires 0.005'' thick; A-M Systems,	Carlsborg WA	767000	Electric stimulation of neuronal cultures. Mentioned in Section 2.1
Circular magnetic coil	Homemade		Magnetic stimulation of neuronal culture. Mentioned in Section 3.3
WaveXpress SW	B&K Precision		Waveform editing software. Mentioned in Section 2.1.32
Xion Ultra 897	Andor		Sensitive EMCCD camera. Mentioned in Section 2.4.4