Qui vi presentiamo una Sorting (FACS) protocollo Fluorescence Activated cellulare per studiare le alterazioni molecolari a Fos-esprimendo ensemble neuronali dal tessuto cerebrale sia freschi che surgelati. L'uso di tessuti congelati permette FACS isolamento di molte aree cerebrali in più sessioni per massimizzare l'uso di soggetti animali preziosi.
È richiesta un abbonamento a JoVE per visualizzare questo contenuto. Accedi o inizia la tua prova gratuita.
Articolo metodologico
Fluorescence Activated di separazione delle cellule (FACS) e Gene Expression Analisi di Fos-esprimono neuroni da freschi e congelati Rat tessuto cerebrale
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Lo studio della neuroplasticità e alterazioni molecolari in comportamenti appresi sta passando dallo studio di regioni cerebrali intere allo studio di specifici gruppi di neuroni attivati scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali che mediano imparato associazioni. La fluorescenza delle cellule Attivato ordinamento (FACS) è stato recentemente ottimizzato per tessuti adulti cervello di ratto e ha permesso l'isolamento dei neuroni attivati utilizzando anticorpi contro il marcatore neuronale NeuN e proteine Fos, un marker di neuroni fortemente attivati. Fino ad ora, i neuroni Fos-esprimere e altri tipi di cellule sono state isolate dal tessuto fresco, che ha comportato lunghi giorni di lavorazione e consentite un numero molto limitato di campioni di cervello per essere valutati dopo le procedure comportamentali lunghe e complesse. Qui abbiamo trovato che i rendimenti di Fos-esprimendo neuroni e Fos mRNA da dorsale striato sono stati simili tra tessuto fresco sezionato e tessuti congelati a -80 ° C per 3 - 21 giorni. Inoltre, abbiamo confermato il fenotipodelle cellule NeuN-positivi e NeuN-negativi ordinate per valutare l'espressione genica di neuronale (NeuN), astrociti (GFAP), oligodendrocitario (Oligo2) e microgial marcatori (Iba1), il che indica che il tessuto congelato può essere utilizzato anche per FACS isolamento tipi di cellule gliali. In generale, è possibile raccogliere, analizzare e congelare il tessuto cerebrale per le sessioni multiple FACS. Questo massimizza la quantità di dati ottenuti da soggetti animali importanti che sono spesso sottoposti a procedure comportamentali lunghe e complesse.
Introduzione
Durante l'apprendimento, gli animali formano associazioni tra insiemi complessi di stimoli altamente specifici. Queste informazioni ad alta risoluzione è pensato per essere codificato da alterazioni all'interno di modelli specifici di neuroni scarsamente distribuiti chiamati complessi neuronali. Ensemble neuronali sono stati recentemente identificati dalla induzione di immediatamente primi geni (IEGs) come Fos, Arco, e Zif268 e dei loro prodotti proteici nei neuroni che sono stati fortemente attivati durante il comportamento o l'esposizione stecca. Fos-esprimendo neuroni, in particolare, hanno dimostrato di giocare un ruolo ca....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato Cura e uso istituzionale animali (IACUC) dei National Institutes of Health Guide per la cura e l'uso di animali da laboratorio 16.
Nota: Tutti i passi sotto tubi di scarso utilizzo vincolante centrifuga che sono stati tenuti in ghiaccio se non diversamente specificato.
1. Preparazione alla Tissue Collection
- Impostare la centrifuga a 4 ° C.
- Fuoco smalto un insieme di tre pipette Pasteur in vetro con decreasing diametri di circa 1,3, 0,8, e 0,4 mm per ogni campione.
- Preparare etichetta....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Risultati
Ordinamento neuroni Fos-positivi e Fos-negativi dal tessuto striato dorsale freschi e congelati da singoli ratti dopo le iniezioni di metanfetamina acute.
Il protocollo descritto sopra è stato usato per ordinare neuroni Fos-positivi e Fos-negativi da un singolo ratto striato dorsale 90 min dopo l'iniezione intraperitoneale di metamfetamina (5 mg / kg). ratti naive nelle loro gabbie a casa sono stati utilizzati come control.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Discussione
FACS possono essere utilizzati per ordinare neuroni e altri tipi di cellule provenienti da tessuti adulti o cerebrale fresco o congelato. Come accennato nell'introduzione, la possibilità di utilizzare tessuti congelati consente un utilizzo ottimale di campioni da animali che sono stati sottoposti a procedure comportamentali complesse e prolungate, quali studi di auto-amministrazione e di ricaduta nella ricerca tossicodipendenza. Queste procedure comportamentali richiede solitamente 1-2 ore o più a lungo, e richiedon.......
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Intramurale NIDA (Bruce T. Hope, Yavin Shaham). F.J.R. è stato sostenuto da una nomina al Programma di Partecipazione alla Ricerca NIDA sponsorizzato dal National Institutes of Health e amministrato dall'Oak Ridge Institute for Science and Education, e ha ricevuto un ulteriore sostegno finanziario da una borsa di studio Becas-Chile gestita da CONICYT e dall'Universidad de los Andes, Santiago, Cile. La struttura Johns Hopkins FACS Core è stata supportata da Award P30AR053503 del National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases del National Institute of Health.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Matrice cerebrale | CellPoint Scientific | 69-2160-1 | per ottenere fette di cervello coronale Ibernazione |
| A bassa fluorescenza | Brain Bits | HA-lf | Il tampone A nel protocollo viene utilizzato per l'elaborazione di tessuti e cellule dalla dissociazione alle fasi di fissazione |
| Accutase | Millipore | SCR005 | La soluzione enzimatica nel protocollo viene utilizzata per la digestione enzimatica del tessuto prima della triturazione |
| Protein LoBind Tube 1,5 ml, PCR clean | Eppendorf | 22431081 | per prevenire la perdita di cellule durante il protocollo |
| Cell Strainer, 40 &; m | BD Falcon | 352340 | per filtrare la sospensione delle celle |
| Cell Strainer, 100 &; micro; m | BD Falcon | 352360 | per filtrare la sospensione cellulare |
| Falcon Provetta in polistirene a fondo tondo da 5 ml con tappo a scatto per filtro cellulare | BD Bioscience | 352235 | per filtrare la sospensione cellulare prima di passare attraverso il citometro a flusso |
| Pasteur Pipet, Glass | NIH supply | 6640-00-782-6008 | per eseguire la triturazione tissutale |
| Milli-Mark Anti-NeuN-PE, Clone A60 (monoclonale di topo) anticorpo | EMD Millipore | FCMAB317PE | anticorpo per rilevare i neuroni |
| Phospho-c-Fos (Ser32) (D82C12) XP Rabbit (Alexa Fluor 647 Conjugate) | Tecnologia di segnalazione cellulare | Anticorpo 8677 | per rilevare le cellule che esprimono Fos |
| DAPI | Sigma | D8417 | per marcare i nuclei |
| Kit di isolamento dell'RNA PicoPure | Applied Biosystems. | KIT0204 | Il kit include il tampone di estrazione dell'RNA per la fase 6.14. Viene utilizzato per raccogliere cellule selezionate |
| Superscript III primo filamento di cDNA sistema | di sintesi Invitrogen | 18080-051 | per sintetizzare il cDNA da RNA |
| TaqMan PreAmp Master Mix | Applied Biosystems. | 4391128 | fare la preamplificazione mirata da cDNA |
| TaqMan Advance Fast Master | Biosistemi Applicati. | 4444963 | fare la PCR utilizzando le sonde TaqMan |
| Fos TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00487426_g1 | TaqMan probe/primers |
| NeuN TaqMan probe | Applied Biosystems. | CACTCCAACAGCGTGAC | per marcatore genico neuronale |
| NeuN Primer diretto | Applied Biosystems. | Sequenza nucleotidica GGCCCCTGGCAGAAAGTAG | per marcatore genico neuronale |
| NeuN Primer inverso | Applied Biosystems. | Sequenza nucleotidica TTCCCCCTGGTCCTTCTGA | per marcatore genico neuronale |
| Gfap TaqMan probe | Applied Biosystems. | Rn00566603_m1 | TaqMan sonda/primer per marcatore genico astrocityc |
| iba-1 sonda TaqMan | Applied Biosystems. | Rn00574125_g1 | TaqMan sonda/primer per marcatore genico microglya |
| Gapdh sonda TaqMan | Applied Biosystems. | CTCATGACCACAGTCCA | sequenza nucleotidica per gene di riferimento/housekeeping |
| Gapdh Forward primer | Applied Biosystems. | GACAACTTTGGCATCGTGGAA | sequenza nucleotidica per gene di riferimento/housekeeping |
| Gapdh Primer inverso | Applied Biosystems. | Sequenza nucleotidica | CACAGTCTTCTGAGTGGCAGTGA |
| la sonda TaqMan TaqMan di riferimento/housekeeping geneOligo2 | Applied Biosystems. | Rn01767116_m1 | Sonda/primer TaqMan per marcatore genico oligodendrocitico |
| Pipettatore P1000 | Rainin | 17014382 | Viene indicato come la pipetta con un grande diametro della punta nelle fasi 3.1 e 3.3 per la triturazione tissutale lieve e nella fase 6.7 per la risospensione delle cellule |
| 7500 Sistema PCR in tempo reale veloce | Applied Biosystems. | 446985 | per PCR quantitativa |
| FACSAria I Cell Sorter | BD Biosciences | per la selezione FACS |
Riferimenti
- Bossert, J. M., et al. Ventral medial prefrontal cortex neuronal ensembles mediate context-induced relapse to heroin. Nat Neurosci. 14, 420-422 (2011).
- Cruz, F. C., et al. Role of nucleus accumbens shell ne....
Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Ristampe e permessi
