फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों की संरचना के बारे में जानकारी प्रदान करते हैं। हम एक एकल चरण क्लोरोफॉर्म मिश्रण, ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों का उपयोग कर निकाला लिपिड के विभाजन, और methanolysis फैटी एसिड मिथाइल एस्टर, जो केशिका गैस क्रोमैटोग्राफी द्वारा विश्लेषण कर रहे हैं का निर्माण करने के साथ मिट्टी के नमूने से निकासी के लिए तरीके प्रस्तुत करते हैं।
फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड (PLFAs) माइक्रोबियल कोशिका झिल्ली के प्रमुख घटक हैं। मिट्टी से निकाला PLFAs के विश्लेषण स्थलीय माइक्रोबियल समुदायों के समग्र संरचना के बारे में जानकारी प्रदान कर सकते हैं। PLFA रूपरेखा के बड़े पैमाने पर समग्र मिट्टी की गुणवत्ता का एक जैविक सूचकांक के रूप में पारिस्थितिक तंत्र की एक श्रृंखला में इस्तेमाल किया गया है, और मिट्टी की प्रतिक्रिया का एक संकेतक के रूप में मात्रात्मक प्रबंधन और अन्य पर्यावरणीय तनाव देश के लिए।
एक एकल चरण क्लोरोफॉर्म मिश्रण के साथ मिट्टी के नमूने से 1. लिपिड निकासी, 2. विभाजन अन्य निकाले लिपिड से फॉस्फोलिपिड को अलग-थलग करने के लिए ठोस चरण निष्कर्षण स्तंभों का उपयोग, 3. फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड का उत्पादन करने के methanolysis: यहां प्रस्तुत मानक पद्धति चार प्रमुख कदम की रूपरेखा मिथाइल एस्टर (fames), और 4. केशिका गैस एक लौ आयनीकरण डिटेक्टर (जीसी खूंटी) का उपयोग कर क्रोमैटोग्राफी द्वारा प्रसिद्धि विश्लेषण। दो मानकों इस्तेमाल कर रहे हैं, 1,2-dinonadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (पीसी (19 सहित:0/19: 0)) निष्कर्षण विधि के समग्र वसूली का आकलन करने के लिए, और मिथाइल decanoate (MeC10: 0) जीसी विश्लेषण के लिए एक आंतरिक मानक (ISTD) के रूप में।
फॉस्फोलिपिड फैटी एसिड (PLFAs) डोमेन बैक्टीरिया और यूकेरिया से माइक्रोबियल सेलुलर झिल्ली का हिस्सा हैं। सूक्ष्मजीवों सेल झिल्ली अखंडता और उनके तत्काल पर्यावरण की स्थिति के जवाब में सेलुलर समारोह को बनाए रखने के लिए एक साधन के रूप में विभिन्न श्रृंखला लंबाई और रचना के PLFAs उत्पादन; इसलिए यह तर्क दिया जा सकता है कि माइक्रोबियल समुदायों कि भौगोलिक दृष्टि से अलग हो रहे हैं लेकिन इसी मिट्टी की स्थिति के अधीन हैं समान PLFAs व्यक्त करेंगे। 14 और 20 सी परमाणुओं के बीच एक श्रृंखला लंबाई के साथ मिट्टी PLFAs आम तौर पर मुख्य रूप से बैक्टीरियल और फंगल उत्पत्ति 1 का होना माना जाता है। मिश्रित संस्कृतियों में, PLFA विश्लेषण व्यक्ति माइक्रोबियल प्रजातियों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, लेकिन यह मिट्टी में पाया माइक्रोबियल समुदायों की एक समग्र फिंगरप्रिंट प्रदान कर सकते हैं। इसके अलावा, क्योंकि PLFAs तेजी से कोशिका मृत्यु पर अपमानित कर रहे हैं, वे व्यवहार्य मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय 2 का प्रतिनिधि माना जा सकता है। इस टीईसीhnique बड़े पैमाने पर वातावरण की एक विस्तृत श्रृंखला में पाया माइक्रोबियल समुदायों, 5-6 घास के मैदानों के लिए जंगलों में 3-4 से लेकर और कृषि क्षेत्रों 7 के संरचनात्मक रचना को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। यह सफलतापूर्वक मिट्टी प्रतिक्रिया निस्र्पक प्रबंधन बदलाव करने के लिए भूमि में लागू किया गया है, जंगल साफ-काटने 8, 9 LiMing, उद्धार 10-12, साथ ही ऐसी आग 13, धातु 14 और हाइड्रोकार्बन 15 से संदूषण के रूप में गड़बड़ी के रूप में शामिल है, और कीट प्रकोप 16 ।
समकालीन PLFA विश्लेषणात्मक विधि पिछले छह अनुसंधान समूहों की एक संख्या से कई महत्वपूर्ण प्रगति के माध्यम से दशकों के दौरान विकसित हुआ। एक दो अवस्था का सिस्टम 17 में monophasic से मिश्रण में बदलाव करने की निकासी के समाधान में पानी के अनुपात: मेथनॉल: 1958 में, एक महत्वपूर्ण सुधार क्लोरोफॉर्म को एडजस्ट करने से पैदा हुई। यह अनुकूलित लिपिड निकासी और संशोधित अलगाव समर्थकtocol Bligh और डायर पद्धति के रूप में जाना गया। प्रोटोकॉल अगले कुछ दशकों में कई प्रयोगशालाओं द्वारा अपनाया गया था और इस समय के दौरान, सफेद और उनके सहयोगियों ने विधि करने के लिए महत्वपूर्ण प्रगति योगदान दिया; उदाहरण के लिए, वे पानी के लिए एक फॉस्फेट बफर आदान प्रदान से निष्कर्षण कदम में सुधार हुआ है, और वे गैस क्रोमैटोग्राफी (जीसी) बढ़ाया चोटी की पहचान और मात्रा का ठहराव के माध्यम से विश्लेषण अनुकूलित। मृदा विज्ञान के लिए अधिक प्रासंगिकता के शायद, वे 1979 में चुना गया है, जब वे समुद्री तलछट 18 के माइक्रोबियल बायोमास की जांच की कि निकाले लिपिड माइक्रोबियल संरचना का एक सूचकांक के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
आगे की घटनाओं में 1980 के दशक में हुई के रूप में विधि अधिक व्यापक रूप से, मृदा विज्ञान के क्षेत्र में उपयोग किया जाने लगा विशेष rhizosphere 19 के संबंध में। उस समय, विधि शामिल मिथाइल nonadecanoate (MeC19: 0) एक आंतरिक मानक 19 और लिपिड विभाजन 21 <के लिए एक सिलिका संबंधी एसिड स्तंभ के उपयोग के रूप में/ Sup>। व्हाइट 19,21 के साथ अपने काम के बाद, Tunlid स्वीडन में लौटे और बाथ और Frostegård के साथ सहयोगात्मक अनुसंधान शुरू कर दिया। कार्बनिक पदार्थ सामग्री में बदलती मिट्टी का एक सूट के लिए अलग निकासी buffers की दक्षता की जांच करके, समूह से पता चला कि साइट्रेट बफर लिपिड फॉस्फेट निकाले की राशि में वृद्धि हुई फॉस्फेट बफर 22 की तुलना में। इसके अलावा, मिट्टी माइक्रोबियल समुदायों पर LiMing के प्रभाव पर उनके 1993 के प्रकाशन 23 पर चला गया मिट्टी जीवविज्ञान और जैव रसायन 24 में एक प्रशस्ति पत्र क्लासिक बन जाते हैं। शोधकर्ताओं ने अपने डाटा प्रोसेसिंग में प्रमुख घटक विश्लेषण का उपयोग किया। PLFA विश्लेषण, के रूप में विधि अब कहा जाता है, बड़े डेटा सेट उत्पन्न करता है और बहुभिन्नरूपी सांख्यिकीय प्रक्रियाओं के उपयोग इन आंकड़ों को प्रोसेस करने में अत्यधिक कई लोगों के लिए समय के लिए अभिनव और प्रेरणादायक था। काम करने के लिए समवर्ती स्वीडन में किया जा रहा है, PLFA प्रक्रिया के लिए संशोधन में जांच की जा रही थीजर्मनी द्वारा Zelles और उनके सहयोगियों ने 25-26। प्रक्रिया के अपने संस्करण एक ठोस चरण निष्कर्षण (एसपीई) स्तंभ के बजाय सिलिका संबंधी एसिड स्तंभ के अपने प्रयोग के लिए उल्लेखनीय था लेकिन, कुल मिलाकर, अधिक प्रयोगशाला था गहन।
Frostegård के पेपर 23, सफेद और Ringelberg 27 से विस्तृत कार्यप्रणाली के साथ-साथ, PLFA तकनीक के उपयोग के मृदा विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक सवालों की जांच करने में एक विस्फोट के लिए नींव प्रदान की है। और C19: तब से, फायरस्टोन और उनके सहयोगियों द्वारा विधि के आगे शोधन के एक आंतरिक जीसी मानक (0 C10): जोड़ने को शामिल किया है मात्रा का ठहराव 28 को सुधारने के लिए एक किराए की मानक के रूप में 0, और जुदा के उपयोग की जगह दौर नीचे शीशियों को सरल करने के लिए funnels निकासी 29। हाल ही में, चौधरी और डिक 30 मेथिलिकरण कदम की जांच की और दो मेथिलिकरण मृदा विज्ञान साहित्य KOH / MeOH विधि अध्यक्ष में इस्तेमाल किया प्रक्रियाओं की सूचना दी है किफैटी एसिड की एक बड़ी रेंज वर्गीकृत।
प्रस्तुत विधि काफी हद तक Bligh और डायर द्वारा विकसित मूल पद्धति पर आधारित है, और इस तरह के कदम के लिए मेथिलिकरण methanolic KOH के उपयोग के रूप में संशोधनों से ऊपर उल्लेख किया है, को शामिल किया गया है। दो मानकों प्रत्येक नमूना के लिए उपयोग किया जाता है, जो मिट्टी नमूना पहले निकासी के लिए पहले से जोड़ा जाता है 1,2-dinonadecanoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine (: 0/19 0) पीसी (19) की एक किराए की मानक दक्षता और पूरे प्रोटोकॉल की वसूली, और मिथाइल decanoate का एक साधन मानक आकलन करने के लिए (MeC10: 0) है, जो जीसी द्वारा की पहचान और मात्रा का ठहराव करने से पहले जोड़ा जाता है।
हम स्वीकार करते हैं कि PLFA विधि आमतौर पर दुनिया भर में कई माइक्रोबियल पारिस्थितिकी प्रयोगशालाओं द्वारा इस्तेमाल किया जाता है, और कई बार दर्ज किया गया है, मानकीकरण 2 के लिए अंतर्राष्ट्रीय संगठन द्वारा भी शामिल है। इस पत्र का उद्देश्य एक आसान पालन करने के लिए और मजबूत प्रोटोकॉल है कि मिट्टी के लिए उपयोगी हो सकता है पेश करने के लिए हैवैज्ञानिकों ने PLFA तकनीक सीखने की कोशिश कर रहे हैं।
कम से कम और PLFA डेटा की गलत व्याख्या से बचने के लिए सावधान डेटा स्क्रीनिंग से किया जाना चाहिए, क्योंकि कुछ PLFAs कि मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय में पाए जाते हैं भी इस तरह के पौधे की जड़ों, शैवाल, और मिट्टी जानवरों के रूप में एकल और बहुकोशिकीय यूकेरियोटिक जीवों में मौजूद हैं। इसके अलावा, आर्किया PLFAs शामिल नहीं है; इसके बजाय, अर्चेअल झिल्ली फॉस्फोलिपिड ईथर लिपिड (PLELs) के शामिल हैं। नतीजतन, PLFA प्रोटोकॉल मिट्टी में अर्चेअल समुदायों को चिह्नित करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता।
विशिष्ट माइक्रोबियल समूहों के लिए अलग-अलग PLFAs जोड़ सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए (PLFA विधि की सीमाओं से कुछ का एक उत्कृष्ट चर्चा के लिए Frostegård और उनके सहयोगियों 34 2011 प्रकाशन देखिए)। इसके बजाय, यह अधिक उपयुक्त हो सकता है के रूप में मध्य चाय के साथ उनकी रासायनिक संरचना के आधार पर चित्रा 2 में किया गया था, समूह PLFAs करने के लिए, उदाहरण के लिए, मैं) सीधे जंजीर संतृप्त PLFAs, द्वितीय) संतृप्त PLFAsn (10 मिथाइल) शाखाओं में बंटी, iii) टर्मिनली-branched संतृप्त फैटी एसिड होता है, iv) मोनोअनसैचुरेटेड PLFAs, वी) पॉलीअनसेचुरेटेड PLFAs, और vi) हाइड्रोक्सी फैटी एसिड होता है।
नमूना वजन एक दिया मिट्टी के नमूने में निहित निष्कर्षण PLFAs की मात्रा के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता हो सकती है। कम microbially सक्रिय मिट्टी में निकाली गई मिट्टी की राशि नहीं समायोजित करके, उन PLFA प्रतिक्रियाओं (चोटियों) के लिए पर्याप्त संख्या में सही समग्र माइक्रोबियल समुदाय का प्रतिनिधित्व करने के लिए प्राप्त नहीं होने का ख़तरा है। PLFAs की उच्च सांद्रता के साथ अत्यधिक microbially सक्रिय मिट्टी में, उपयोगकर्ताओं को जीसी स्तंभ ओवरलोडिंग, जिससे PLFAs की सही मात्रा का ठहराव को रोकने का खतरा होता है। दोनों ही मामलों में, मिट्टी के नमूने PLFAs के लिए फिर से विश्लेषण किया जाना चाहिए। एक अच्छा प्रारंभिक बिंदु (जैसे वन फर्श के रूप में) कार्बनिक मिट्टी के नमूने के लिए 0.5 ग्राम, और खनिज मिट्टी के नमूने के लिए लगभग 3 जी जोड़ने के लिए है। चूंकि निष्कर्षण PLFAs की मात्रा आम तौर पर एक मिट्टी, नमूना हम में निहित कार्बनिक कार्बन की मात्रा को जोड़ा जाता हैight मिट्टी में कार्बन की मात्रा के आधार पर समायोजित किया जा सकता है, जैसे, खनिज मिट्टी के नमूने की 1 ग्राम, एक अच्छा PLFA मात्रा का ठहराव प्राप्त करने के लिए जब कार्बन की मात्रा 10-15% है पर्याप्त हो सकता है, जबकि> 5 ग्राम आवश्यक हो सकता है यदि कार्बन की मात्रा 0.5 ≤ है %। यह हमेशा से पहले पूरे सेट चलाया जाता है नमूना वजन अनुकूलन करने के लिए कुछ नमूने के साथ एक परीक्षण चलाने के लिए एक अच्छा विचार है।
PLFA प्रोटोकॉल और जीसी विश्लेषण के लिए आम समस्या निवारण रणनीतियों इस प्रकार हैं। जीसी वर्णलेख आधारभूत बहुत अधिक है, एच 2 गैस सिलेंडर बदला जाना चाहिए। विलायक या ISTD चोटियों वर्णलेख से याद कर रहे हैं, वहाँ नमूना इंजेक्शन के साथ एक समस्या हो सकती है (जैसे, सिरिंज, autosampler के साथ समस्या है, खाली शीशी या लापता, शीशी स्थिति के साथ त्रुटि खामियों को दूर किया)। तीन से अधिक चोटियों विधि / नमूना रिक्त में पता चला रहे हैं, तो वहां के प्रदूषण खाली है, और वहाँ एक उच्च संभावना है कि एक ही प्रदूषक (s) नमूना जीसी ग में उपस्थित होना होगाhromatograms। प्रदूषण का स्रोत (आमतौर पर जलीय मीडिया) का पता लगाएं, या बहुत कम से कम, यह सुनिश्चित करें कि चोटियों दूषित पदार्थों को इसी नमूना chromatograms से और है कि इन चोटियों PLFA डेटा के किसी भी सांख्यिकीय विश्लेषण में शामिल नहीं हैं हटा रहे हैं। इसके अलावा, यह एक अच्छा विचार हेक्सेन नमूनों के बीच rinses जब कैरी ओवर संदेह है चलाने के लिए है। हेक्सेन कुल्ला में अतिरिक्त चोटियों कैरी ओवर (यानी, भारी घटकों पिछले रन से एल्यूटिंग) का संकेत होगा।
लिपिड विशेष रूप से ऑक्सीकरण के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, और विशेष रूप से ध्यान में इस तरह उन्हें अंधेरे में भंडारण और उन्हें नाइट्रोजन के तहत रखने के रूप में हवा और प्रकाश जोखिम से नमूने, की रक्षा के लिए प्रोटोकॉल भर में प्रयोग किया जाना चाहिए। 0 सरोगेट मानक: सभी नमूनों और कारतूस पर्याप्त C19 होना चाहिए। एक लापता C19: 0 शिखर, या तो नमूने या रिक्त स्थान, एक गरीब वसूली या analytes का एक पूरा नुकसान इंगित करता है। नमूनों में 0 कि मीटर की तुलना में काफी कम है: C19 की प्रतिक्रियाethod / नमूना कारतूस PLFA कार्यप्रणाली में कुछ बिंदु पर analytes की एक नुकसान इंगित करता है। जब गरीब C19 के साथ सामना: 0 वसूली, प्रक्रिया के सभी पहलुओं को ध्यान से विचार किया जाना है और प्रारंभिक निकासी, नमूना हस्तांतरण के सभी चरणों, विशेष निकासी, फैटी एसिड मेथिलिकरण, सुखाने, भंडारण और नमूना हेरफेर आदेश को अलग करने में शामिल की जांच की मंच या चरणों जहां analytes खो रहे हैं। दूसरी ओर, यह हो सकता है कि कुछ मिट्टी के नमूने की निकासी उपज हो सकती C19: 0, जिसमें किराए की मानक के मामले वसूली overestimated जा सकता है। दो मानकों का प्रयोग करते हुए ((पीसी (19: 0/19: 0) और MeC10: 0) नहीं एक परम आवश्यकता है, हम इस मिल गया है जब समस्याओं का निवारण करने की आवश्यकता होगी, बहुत उपयोगी हो सकता है जब तक MeC10 के रूप में:। 0 प्रतिक्रिया पर्याप्त है , समस्या निवारण चरणों जीसी विश्लेषण करने से पहले पर ध्यान केंद्रित कर सकते हैं।
जैसा कि पहले उल्लेख, सावधानी जब पूरी तरह बायोमार्कर निकाले जाते हैं पर आधारित पारिस्थितिक महत्व और पारिस्थितिकी तंत्र के रिश्तों की व्याख्या इस्तेमाल किया जाना चाहिएPLFA डेटा से डी, क्योंकि शुद्ध संस्कृति के अध्ययन से पता चलता है कि पृथक जीवाणु उपभेदों PLFAs की विभिन्न श्रेणियों में शामिल होंगे। इसके बजाय, बायोमार्कर PLFAs जब व्यापक पारिस्थितिक inferences बनाने सबूत का एक सूट में एक उपयोगी इसके अतिरिक्त के रूप में देखा जाना चाहिए। साहित्य में, अलग-अलग PLFAs प्रस्ताव किया है और विभिन्न समूहों के लिए माइक्रोबियल बायोमार्कर के रूप में उपयोग किया गया है। संतृप्त PLFAs आम तौर पर ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया का प्रतिनिधित्व करने के लिए इस्तेमाल किया और PLFA मोनोअनसैचुरेटेड ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए किया जाता है। 1ω7, C18: 1ω7, और C18: ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया के लिए मान्यता प्राप्त बायोमार्कर ऐसे C16 के रूप में ω5 या ω7 स्थिति, पर unsaturation साथ मोनोअनसैचुरेटेड फैटी एसिड शामिल 1ω5। इसके अलावा, cyclopropyl फैटी एसिड भी ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया 35 का प्रतिनिधि हो सकता है। 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo इसलिए, ग्राम नकारात्मक बैक्टीरिया से PLFAs की राशि के बराबर के रूप में गणना की जा सकती है। ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया के लिए मान्यता प्राप्त बायोमार्कर टर्मिनली SA branched रहे हैंturated फैटी एसिड होता है, आईएसओ branched C15 जैसे: 0i, C16: 0i, C17: 0i; 0A और C17: 0A या ऐसे C15 के रूप में, anteiso-branched। मध्य श्रृंखला (10 मिथाइल) शाखाओं में बंटी के साथ संतृप्त PLFAs, जैसे 10Me16: 0 और 10Me18: 0 actinomycetes 36 में विशेषता से मौजूद हैं। इस प्रकार, ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया से PLFAs एक की राशि के रूप में बराबर की गणना की जा सकती है: 0 (आईएसओ, ANTEISO, 10-मिथाइल)।
फंगल PLFA के साथ जुड़े कई बायोमार्कर अक्सर पॉलीअनसेचुरेटेड कर रहे हैं, लेकिन कुछ कवक बायोमार्कर मोनोअनसैचुरेटेड रहे हैं। उदाहरण के लिए, फंगल monounsaturated बायोमार्कर के मामले में, C16: 1ω5 arbuscular मायकोरिजल कवक का सूचक (AMF) 37, C18 के रूप में पहचान की गई है: 1ω9 saprophytic कवक में आम है, और आम तौर पर ectomycorrhizae C16 होते हैं: 1ω9। के DI-असंतृप्त C18 उपस्थिति: 2ω6,9 अक्सर C18 के साथ संयोजन के रूप में होता है: 1ω9 और भी फंगल sterol ergosterol, जो इंगित करता है कि C18 के साथ अच्छी तरह से संबद्ध: 2ω6,9 पर्याप्त रूप से प्रतिनिधित्व कर सकते हैं ectomycorrhizae और saprophytic कवक 38। त्रि-असंतृप्त C18: 3ω 6,9,12 भी कवक 10 के लिए एक बायोमार्कर के रूप में इस्तेमाल किया गया है; हालांकि, C18: 3ω6c पौधों और शैवाल सहित अन्य यूकेरियोटिक जीवों में पाया जा सकता है, हालांकि यह आमतौर पर बैक्टीरिया में नहीं पाया जाता है। मिट्टी प्रोटिस्टों की अवधि में, C20: 4ω6c, एक protist बायोमार्कर 39 के रूप में स्वीकार किया गया है, हालांकि, अन्य काम C20 पता लगाने में विफल: 4ω6c भी जब व्यवहार्य protist आबादी नेत्रहीन प्रकाश माइक्रोस्कोपी 40 का उपयोग कर पुष्टि की गई।
कई अध्ययनों से एक PLFA डेटा विश्लेषण उपकरण के रूप में बहुभिन्नरूपी समन्वय तकनीक का उपयोग करके समग्र मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय से संबंधित सवालों को संबोधित पारिस्थितिक। इस दृष्टिकोण का उपयोग कर, कुछ लेखकों PLFAs कि नमूने 4 कम से कम 5% में मौजूद हैं हटाने के द्वारा डाटासेट से दुर्लभ PLFAs बाहर करने के लिए चुना है। सामान्य संतृप्त C16: 0 और C18: 0 सभी मिट्टी सूक्ष्मजीवों में प्रचुर मात्रा में हैं, prokaryotes और euk सहितaryotes। इसलिए, कुछ शोधकर्ताओं का आधार यह है कि वे मिट्टी माइक्रोबियल समुदाय की रचना की संवेदनशील संकेतक नहीं हो सकता है पर सांख्यिकीय विश्लेषण करने से पहले इन PLFAs को दूर करने के लिए चुन – हालांकि C16: 0 और C18: 0 अभी भी कर रहे हैं जब सभी के लिए PLFAs संक्षेप शामिल होने के लिए माइक्रोबियल बायोमास की एक सूची। सांख्यिकीय विश्लेषण की अवधि में, कई शोधकर्ताओं के रूप में इस तकनीक को अच्छी तरह से डेटा है कि सामान्य रूप से 33 से वितरित नहीं किया जा सकता है के लिए अनुकूल है एक गैर मीट्रिक बहुआयामी स्केलिंग (NMDS) समन्वय का संचालन करने के लिए चुनते हैं। स्पष्ट चर से संबंधित अतिरिक्त विश्लेषण सूचक प्रजातियों विश्लेषण है, जो स्पष्ट समूहों और बहु प्रतिक्रिया क्रमचय प्रक्रियाओं (MRPP) के लिए विशिष्ट PLFAs, जो समानताएं या मतभेद का निर्धारण स्पष्ट समूहों को सौंपा माइक्रोबियल समुदायों के बीच मदद कर सकते हैं की घटना से संबंधित कर सकते शामिल कर सकते हैं। इसके अतिरिक्त, बहुभिन्नरूपी प्रतिगमन पेड़ (एमआरटी) विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है जब कई प्रयोगात्मक चर के प्रभाव याउपचार के संभावित व्याख्यात्मक चर 5 के रूप में मूल्यांकन करने की जरूरत है (जैसे, मिट्टी की बनावट, नमी, उद्धार उम्र)।
एक बार स्थापित, PLFA प्रोटोकॉल एक अपेक्षाकृत सरल विश्लेषणात्मक विधि है कि बहुत उपयोगी हो सकता है जब पर्यावरण परिवर्तन और मानवीय अशांति के लिए मिट्टी माइक्रोबियल प्रतिक्रिया बढ़ाता है। हालांकि ऐसे आनुवंशिक फिंगरप्रिंटिंग के रूप में आणविक तकनीक बेहतर माइक्रोबियल समुदायों की विस्तृत लक्षण वर्णन के लिए अनुकूल हैं, PLFA विधि कुल माइक्रोबियल बायोमास 34 पर मात्रात्मक जानकारी प्रदान करने का लाभ प्रस्तुत करता है। हमारे शोध प्रयोगशाला में, एक व्यक्ति आराम से 4 दिनों में 20 नमूनों में से एक सेट प्रक्रिया कर सकते हैं, और हम यहाँ प्रस्तुत मिट्टी जैविक गुणवत्ता का आकलन करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य तकनीक होना प्रोटोकॉल पाया है।
PLFA विधि की शक्ति बहुत स्थिर आइसोटोप विश्लेषण 41, 42 के लिए यह युग्मन द्वारा बढ़ाया जा सकता है। विशेष रूप से, इसके अलावा ओएफ मिट्टी के लिए 13 सी लेबल substrates मिट्टी सूक्ष्मजीवों में सब्सट्रेट समावेश की मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है, हालांकि अलग-अलग PLFAs 41 के समस्थानिक विश्लेषण। इसके अलावा, इस विधि मिट्टी खाद्य जाले 42 में पौष्टिकता लिंक को स्पष्ट करने के लिए एक बहुत ही होनहार उपकरण प्रतीत होता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |