Fosfolipid fettsyrer gir informasjon om strukturen av jord mikrobielle samfunn. Vi presenterer fremgangsmåter for utvinning av jordprøver med en enfaset kloroform blanding, fraksjonering av ekstraherte lipider ved hjelp av fastfase-ekstraksjon kolonner, og metanolyse for å fremstille fettsyremetylestere, som analyseres ved kapillar gasskromatografi.
Fosfolipid fettsyrer (PLFAs) er sentrale komponenter i mikrobielle cellemembraner. Analysen av PLFAs hentet fra jord kan gi informasjon om den overordnede strukturen av terrestriske mikrobielle samfunn. PLFA profilering har vært mye brukt i en rekke økosystemer som en biologisk indeks over generelle jordkvalitet, og som en kvantitativ indikator på jord respons på arealforvaltningen og andre miljømessige stressfaktorer.
Standardmetoden som presenteres her skisserer fire hovedtrinn: 1. lipid ekstraksjon fra jordprøver med en enfaset kloroformblanding, 2. fraksjonering ved hjelp av fastfase-ekstraksjon kolonner for å isolere fosfolipider fra andre ekstraherte lipider, 3. metanolyse av fosfolipider for å produsere fettsyre metylestere (fames), og 4. FAME analyse ved kapillær gasskromatografi ved anvendelse av en flammeioniseringsdetektor (GC-FID). To standarder er brukt, inkludert 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-phosphocholine (PC (19:0/19: 0)) til å vurdere den samlede utvinning av utvinningsfremgangsmåten, og metyl-dekanoat (MeC10: 0) som indre standard (ISTD) for GC-analyse.
Fosfolipid fettsyrer (PLFAs) er en del av mikrobielle cellemembraner fra domenene bakterier og Eukarya. Mikroorganismer produserer PLFAs med forskjellig kjedelengde og sammensetning som et middel for å opprettholde cellemembranintegritet og cellulær funksjon som reaksjon på deres umiddelbare miljøbetingelser; dermed kan det hevdes at bakteriesamfunn som er atskilt geografisk, men er utsatt for tilsvarende grunnforhold vil uttrykke lignende PLFAs. Jord PLFAs med en kjedelengde mellom 14 og 20 C-atomer er vanligvis ansett for å være hovedsakelig av bakterie- og sopp opprinnelse 1. I blandingskulturer kan PLFA analyse ikke anvendes for å identifisere individuelle mikrobielle arter, men det kan gi en samlet fingeravtrykk av de mikrobielle samfunn som finnes i jordsmonn. I tillegg, siden PLFAs hurtig nedbrytes ved celledød, de kan anses å være representative for de levedyktige mikrobielle jord fellesskap 2. dette technique har vært mye brukt for å karakterisere strukturelle sammensetningen av bakteriesamfunn som finnes i en rekke miljøer, alt fra skoger 3-4 til prærier 5-6 og landbruks felt 7. Det har blitt brukt for å karakterisere jord respons til land leder endringer, inkludert skog klar-kutte 8, 9 liming, gjenvinningen 10-12, så vel som forstyrrelser som brann 13, forurensning av metaller 14 og 15 hydrokarboner, og insekt utbrudd 16 .
Den moderne PLFA analysemetode utviklet seg i løpet av de siste seks tiårene gjennom flere viktige fremskritt av en rekke forskningsgrupper. I 1958, en betydelig forbedring oppsto fra justering av kloroform: metanol: vann-forholdet i ekstraksjonsløsningen å skifte blandingen fra en monofasisk til et tofaset system 17. Denne optimaliserte lipid ekstraksjon og den reviderte isolasjon proprotokollen ble kjent som Bligh og Dyer metoden. Protokollen ble vedtatt av mange laboratorier i løpet av de neste tiårene, og i løpet av denne tiden, hvit og kolleger bidro betydelige fremskritt mot metoden; for eksempel, forbedret de ekstraksjonstrinnet ved å utveksle en fosfatbuffer for vann, og de optimalisert analyse ved gasskromatografi (GC) ved hjelp av forbedret topp identifisering og kvantifisering. Kanskje mer relevans til jord vitenskap, bestemte de i 1979 at de utpakkede lipider kan brukes som en indeks av mikrobiell struktur når de undersøkte mikrobiell biomasse av marine sedimenter 18.
Videre utvikling fant sted i 1980 da metoden ble mer utbredt benyttet i jord vitenskap, spesielt i forhold til rhizosphere 19. På den tiden, idet fremgangsmåten er inkludert metyl nonadecanoate (MeC19: 0) som indre standard 19 og bruk av en kiselsyre-kolonne for fraksjonering lipid 21 </ Sup>. Etter hans arbeid med Hvit 19,21, Tunlid tilbake til Sverige og begynte forskningssamarbeid med Bååth og Frostegård. Ved å undersøke effektiviteten av forskjellige utvinningsbuffere for en pakke med jord varierende innhold av organiske bestanddeler, gruppen viste at citratbufferen økte mengden av lipid fosfat ekstrahert sammenlignet med fosfatbufferen 22. Videre deres 1993 publikasjon 23 på påvirkning av kalking på jord mikrobielle samfunn gikk videre til å bli et sitat klassiker i Soil Biology & Biochemistry 24. Forskerne benyttet prinsipal komponent analyse i sin databehandling. PLFA analyse, som metoden kalles nå, genererer store datasettene og bruk av multivariate statistiske fremgangsmåter for å behandle disse data var svært innovative for tiden og inspirasjon for mange. Samtidig med arbeidet som gjøres i Sverige, ble endringer i PLFA prosedyren blir etterforsket iTyskland ved Zelles og kolleger 25-26. Sin versjon av prosedyren var kjent for sin bruk av en fast-fase ekstraksjon (SPE) kolonne i stedet for kiselsyre kolonnen men samlet, var mer laboratoriekrevende.
Frostegård papir 23, sammen med detaljerte metoder ved White & Ringelberg 27, dannet grunnlaget for en eksplosjon i bruken av PLFA teknikk for å undersøke grunnleggende spørsmål i jord vitenskap. Siden den gang har ytterligere forbedringer av metoden Firestone og kolleger inkludert å legge en intern GC standard (C10: 0) og C19: 0 som et surrogat standard for å bedre kvantifisering 28, og erstatte bruk av skille trakter for runde bunn ampuller å forenkle utvinning 29. Mer nylig, Chowdhury og Dick 30 undersøkte metylering trinnet og rapporterte at de to metylering prosedyrer som brukes i jorden vitenskap litteraturen KOH / MeOH metode identsert et større spekter av fettsyrer.
Den presenterte fremgangsmåte er i stor grad basert på den originale metode utviklet av Bligh og Dyer, og inkorporerer modifikasjoner som er nevnt ovenfor, for eksempel ved bruk av metanolisk KOH for metylering trinnet. To standarder benyttes for hver prøve: et surrogat standard av 1,2-dinonadecanoyl- sn -glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)), som er lagt til jord prøven før den første ekstraksjon for å vurdere effektiviteten og gjenvinning av hele protokollen, og et instrument standard metyl- dekanoat (MeC10: 0), som tilsettes før identifikasjon og kvantifisering av GC.
Vi erkjenner at PLFA metoden er ofte brukt av mange mikrobiell økologi laboratorier over hele verden, og har blitt dokumentert mange ganger, blant annet av International Organization for Standardization to. Formålet med denne artikkelen er å presentere en enkel å følge og robust protokoll som kan være nyttig for jordforskere som prøver å lære PLFA teknikk.
For å minimere og unngå feiltolkning av PLFA data, må nøye data screening gjøres fordi noen PLFAs som finnes i jord mikrobielle samfunn er også til stede i enkeltrom og flercellede eukaryote organismer, som for eksempel planterøttene, alger, og jord dyr. I tillegg trenger Archaea ikke inneholde PLFAs; i stedet blir archaeal membraner består av fosfolipid-eterlipider (PLELs). Følgelig kan PLFA protokollen ikke benyttes til å karakterisere archaeal miljøer i jord.
Knytte individuelle PLFAs til bestemte mikrobielle grupper bør utvises forsiktighet (se 2011 publikasjon av Frostegård og kolleger 34 for en utmerket diskusjon av noen av begrensningene til PLFA metoden). I stedet kan det være mer hensiktsmessig, slik det ble gjort i figur 2, for å gruppere PLFAs basert på deres kjemiske struktur, for eksempel, i) rettkjedede mettede PLFAs, ii) mettet med PLFAs mid-chaiN (10-metyl) forgrening, iii) terminalt-forgrenede mettede fettsyrer, iv) enumettet PLFAs, v) polyumettede PLFAs, og VI) hydroxy fettsyrer.
Prøve vekt må kanskje justeres basert på mengden av ekstraherbare PLFAs som finnes i en gitt jordprøve. Ved ikke å justere mengden jord ut i mindre mikrobielt aktive jordsmonn, brukerne er i fare for ikke å få et tilstrekkelig antall PLFA svar (topper) til nøyaktig representere den totale mikrobielle samfunn. I svært mikrobielt aktive jord med høye konsentrasjoner av PLFAs, brukerne er i fare for overbelastning av GC-kolonnen, og dermed hindre nøyaktig kvantifisering av PLFAs. I begge tilfeller, jordprøver må igjen analyseres for PLFAs. Et godt utgangspunkt er å legge til 0,5 g for økologiske jordprøver (for eksempel skog etasjer), og ca 3 g for mineraljordprøver. Siden mengden av ekstraherbare PLFAs er vanligvis korrelert til mengden av organisk karbon i en jord, prøve viight kan justeres på grunnlag av jord karboninnhold, for eksempel, kan en g mineraljordprøve være tilstrekkelig til å oppnå en god PLFA kvantifisering når karboninnholdet er 10-15%, mens> 5 g kan være nødvendig hvis karboninnholdet er 0,5 ≤ %. Det er alltid en god idé å gjøre en prøvetur med noen prøver å optimalisere prøve vekt før hele settet kjøres.
Vanlige feilsøkings strategier for PLFA protokollen og GC-analyse er som følger. Dersom GC kromatogrammet grunnlinjen er for høy, bør H 2 gassflaske endres. Dersom løsemiddel eller ISTD topper mangler fra kromatogrammet, kan det være et problem med prøveinjeksjon (f.eks plugget sprøyte, problem med autosampler, tom eller mangler hette feil med hette posisjonering). Dersom mer enn tre topper detekteres ved fremgangsmåten / blindprøve, er forurensning av emnet, og det er en stor sannsynlighet for at den samme forurensningen (e) vil være tilstede i prøven GC chromatograms. Finne kilden for forurensning (vanligvis vandige media), eller i det minste å sikre at toppene tilsvarende forurensningen er fjernet fra prøve kromatogrammene, og at disse toppene er ikke inkludert i noen statistisk analyse av dataene PLFA. Dessuten er det en god idé å kjøre heksan skyller mellom prøver ved mistanke om carry-over. Flere topper i heksan skylle vil indikere carry-over (dvs. tyngre komponenter som elueres fra forrige løp).
Lipider er spesielt utsatt for oksidasjon, og spesiell forsiktighet må utøves gjennom protokollen for å beskytte prøver fra luft og lys eksponering, for eksempel lagre dem i mørket og holde dem under nitrogen. Alle prøver og blanks må ha tilstrekkelig C19: 0 surrogat standard. En manglende C19: 0-topp, i enten prøver eller blanke, indikerer en dårlig gjenvinning eller et fullstendig tap av analytter. En reaksjon av C19: 0 i prøvene som er betydelig lavere enn den method / sample blanks indikerer et tap av analytter på et tidspunkt i PLFA metodikk. Når man står overfor dårlig C19: 0 utvinning, alle aspekter av fremgangsmåten må være nøye vurdert og undersøkt, inkludert den første ekstraksjonen, alle stadier av prøveoverføring, SPE ekstraksjon, fettsyre metylering, tørking, lagring og sample manipulasjon for å isolere trinn eller stadier hvor analytter er tapt. På den annen side kan det være at utvinning av enkelte jordprøver kan gi C19: 0, i hvilket tilfelle utvinning av surrogat standarden kan overvurderes. Mens du bruker to standarder ((PC (19: 0/19: 0) og MeC10: 0) er ikke et absolutt krav, vi har funnet dette å være svært nyttig når du trenger å feilsøke Så lenge MeC10. 0 svar er tilstrekkelig kan feilsøking fokusere på trappen før GC-analyse.
Som tidligere nevnt, må det utvises forsiktighet ved tolkning økologiske betydning og økosystem relasjoner basert utelukkende på biomarkører utleded fra PLFA data, fordi rene kulturstudier viser at isolerte bakteriestammer vil inneholde ulike kategorier av PLFAs. I stedet bør biomarkør PLFAs bli sett på som et nyttig tillegg i en pakke med bevis når du gjør bredere økologiske slutninger. I litteraturen har individuelle PLFAs blitt foreslått og anvendt som biomarkører for ulike mikrobielle grupper. Mettede PLFAs blir typisk brukt til å representere gram-positive bakterier og enumettede PLFA brukes for gram-negative bakterier. Anerkjente biomarkører for gram-negative bakterier omfatter enumettede fettsyrer med umetningen ved ω5 eller ω7 stilling, som for eksempel C16: 1ω7, C18: 1ω7, og C18: 1ω5. I tillegg kan syklopropyl- fettsyrer også være representativ for gram-negative bakterier 35. Derfor kan PLFAs fra gram-negative bakterier bli beregnet som er lik summen av A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Anerkjent biomarkører for gram-positive bakterier er terminalt forgrenet SAturated fettsyrer, iso-forgrenet slik som C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; eller anteiso-forgrenet, for eksempel C15: 0a og C17: 0a. Mettet PLFAs med middels kjede (10-metyl) forgrening, som for eksempel 10Me16: 0 og 10Me18: 0 er karakteristisk til stede i actinomycetes 36. Således kan PLFAs fra gram-positive bakterier bli beregnet som er lik summen av A: 0 (ISO, ANTEISO, 10-methyl).
Mange biomarkører forbundet med sopp PLFA er ofte flerumettede, men noen sopp biomarkører enumettet. For eksempel i form av sopp enumettet biomarkører, C16: 1ω5 har blitt identifisert som en indikator på arbuscular mykorrhizasoppene (AMF) 37, C18: 1ω9 er vanlig i saprophytic sopp, og ectomycorrhizae typisk inneholde C16: 1ω9. Tilstedeværelsen av di-umettede C18: 2ω6,9 forekommer ofte i forbindelse med C18: 1ω9 og korrelerer også godt med den sterol fungal ergosterol, noe som indikerer at C18: 2ω6,9 kan tilstrekkelig representere ectomycorrhizae og saprophytic sopp 38. Tri-umettede C18: 3ω 6,9,12 har også blitt brukt som en biomarkør for sopp 10; imidlertid, C18: kan 3ω6c finnes i andre eukaryote organismer som planter og alger, selv om det vanligvis ikke er funnet i bakterier. På sikt av jord protister, C20: har 4ω6c blitt anerkjent som en protoktister biomarkør 39, selv om, annet arbeid ikke klarte å oppdage C20: 4ω6c selv når levedyktige protoktister populasjoner ble bekreftet visuelt ved hjelp av lysmikroskopi 40.
Mange studier ta økologiske spørsmål knyttet til den generelle jord mikrobielle samfunn ved å benytte multivariate koordinering teknikker som PLFA data analyseverktøy. Ved bruk av denne tilnærmingen, har enkelte forfattere valgt for å utelukke sjeldne PLFAs fra datasettet ved å fjerne PLFAs som er til stede i mindre enn 5% av prøvene 4. Den normale mettede C16: 0 og C18: 0 er rikelig i alle jord mikroorganismer, inkludert prokaryoter og EUKaryotes. Derfor noen forskere velger å fjerne disse PLFAs før statistisk analyse på grunnlag av at de ikke kan være sensitive indikatorer på sammensetningen av jordsmonnet mikrobielle samfunnet – selv om C16: 0 og C18: 0 er fortsatt å bli inkludert når summere alle PLFAs for en indeks av mikrobiell biomasse. På sikt av statistiske analyser, mange forskere velger å gjennomføre en ikke-metriske multidimensjonal skalering (NMDS) ordinasjonen som denne teknikken er godt egnet til data som ikke kan bli normalfordelt 33. Ytterligere analyser knyttet til kategoriske variabler kan inkludere indikatorarter analyse, som kan relatere forekomsten av spesifikke PLFAs til kategoriske grupperinger og flere svar permutasjon prosedyrer (MRPP), som kan hjelpe bestemme likheter eller forskjeller mellom mikrobielle samfunn tildelt kategoriske grupper. I tillegg kan multivariate regresjons trær (MRT) være spesielt nyttig når påvirkningen av flere eksperimentelle variabler ellerbehandlinger må vurderes som potensielle forklaringsvariabler 5 (f.eks jord tekstur, fuktighet, gjenvinning alder).
Når etablert, er det PLFA protokollen en relativt enkel analysemetode som kan være svært nyttig når kvantifisere jord mikrobiell respons på miljøendringer og menneskeskapte forstyrrelser. Selv om molekylære teknikker som genetisk fingeravtrykk er bedre egnet til den detaljerte karakteriseringen av mikrobielle samfunn, presenterer den PLFA fremgangsmåten den fordelen av å gi kvantitativ informasjon om total mikrobiell biomasse 34. I vårt forskningslaboratorium, kan en person komfortabelt behandle et sett med 20 prøver over 4 dager, og vi har funnet protokollen presenteres her for å være en robust og reproduserbar teknikk for å vurdere jord biologisk kvalitet.
Kraften av PLFA fremgangsmåten kan sterkt forlenges ved å koble det til en stabil isotop-analyse 41, 42. Spesielt tilsetning of 13 C-merkede substrater til jord tillater kvantifisering av substratet inkorporering i jord mikroorganismer selv om isotopisk analyse av individuelle PLFAs 41. I tillegg vises denne metoden til å være en svært lovende verktøy for å belyse trofiske koblinger i jord næringskjeder 42.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |