Fosfolipid fettsyror ger information om strukturen av markmikrobiella samhällen. Vi presenterar metoder för extraktion från jordprover med en enfasig kloroformblandning, fraktionering av extraherade lipider med användning av fast fas extraktionskolonner och metanolys för att producera fettsyrametylestrar, som analyseras genom kapillär gaskromatografi.
Fosfolipid fettsyror (PLFAs) är viktiga komponenter i mikrobiella cellmembran. Analysen av PLFAs utvinns ur marken kan ge information om den övergripande strukturen av markmikrobiella samhällen. PLFA profilering har i stor utsträckning använts i en rad olika ekosystem som en biologisk index av den totala markkvalitet, och som en kvantitativ indikator på mark svar på markförvaltning och andra miljöfaktorer.
Standardmetoden som presenteras här beskriver fyra viktiga steg: 1. lipidextraktion från jordprover med en enfas kloroform blandning, 2. fraktionering med användning fastfasextraktion kolumner för att isolera fosfolipider från andra extraherade lipider, 3. metanolys av fosfolipider för att producera fettsyra metylestrar (FAME), och 4. FAME-analys genom kapillär gaskromatografi med användning av en flamjonisationsdetektor (GC-FID). Två standarder används, inklusive 1,2-dinonadecanoyl–sn-glycero-3-fosfokolin (PC (19:0/19: 0)) för att bedöma den totala återvinningen av extraktionsmetod och metyl dekanoat (MeC10: 0) som en intern standard (ISTD) för GC-analys.
Fosfolipid fettsyror (PLFAs) är en del av mikrobiella cellmembran från domänerna Bakterier och Eukarya. Mikroorganismer producerar PLFAs av olika kedjelängder och sammansättning som ett sätt att upprätthålla cellmembranintegritet och cellfunktion som svar på deras omedelbara miljöförhållanden; varför det kan hävdas att mikrobiella samhällen som är separerade geografiskt, men utsätts för liknande markförhållanden kommer att uttrycka liknande PLFAs. Jord PLFAs med en kedjelängd mellan 14 och 20 C-atomer är typiskt anses vara av övervägande bakterie- och svampursprung 1. I blandade kulturer, kan PLFA analys inte användas för att identifiera enskilda mikrobiella arter, men det kan ge en övergripande fingeravtryck av de mikrobiella samhällen som finns i jord. Eftersom PLFAs bryts snabbt ned på celldöd, de kan anses vara representativ för den livskraftiga jord mikrobiella samhället 2. denna technique har i stor utsträckning använts för att karakterisera den strukturella sammansättningen av mikrobiella samhällen som finns i ett brett spektrum av miljöer, som sträcker sig från skogar 3-4 till Prairies 5-6 och jordbruksfält 7. Det har framgångsrikt tillämpats i karakterisera jord svar att landa ledningsförändringar, inklusive skog kalavverkning 8, kalkning 9, återvinning 10-12, liksom störningar såsom brand 13, förorening av metaller 14 och kolväten 15, och insektsutbrott 16 .
Den moderna PLFA analysmetod utvecklats under de senaste sex åren genom flera viktiga framsteg genom ett antal forskargrupper. 1958, en betydande förbättring uppstod från justering av kloroform: metanol: vatten-förhållandet i extraktionslösningen att skifta blandningen från en monofasisk till en tvåfasig systemet 17. Detta optimerade lipidextraktion och den reviderade isolering proprotokoll blev känd som Bligh och Dyer metod. Protokollet antogs av många laboratorier under de kommande årtiondena och under denna tid, vit och kollegor bidrog betydande framsteg av metoden; till exempel, förbättrades de extraktionssteget genom utbyte av en fosfatbuffert för vatten, och de optimerade analysen med gaskromatografi (GC) genom ökad identifiering och kvantifiering topp. Kanske mer relevant för markvetenskap, bestäms de 1979 att de extraherade lipider skulle kunna användas som ett index på mikrobiell struktur när de undersökte den mikrobiella biomassan av marina sediment 18.
Ytterligare utvecklingar inträffade på 1980-talet som den metod som blev mer allmänt används i markvetenskap, särskilt i förhållande till rotområdet 19. Vid den tiden inkluderade metoden metyl nonadecanoate (MeC19: 0) som en intern standard 19 och användningen av en kiselsyrakolonn för lipid fraktione 21 </ Sup>. Efter hans arbete med vit 19,21, Tunlid återvände till Sverige och började forskningssamarbete med Bååth och Frostegård. Genom att undersöka effektiviteten hos olika utvinnings buffertar för en svit av jordar med varierande halt av organiskt material, gruppen visade att citratbuffert ökade mängden lipid extraherade fosfatet jämfört med fosfatbufferten 22. Vidare, deras 1993 publikation 23 på påverkan av kalkning på markmikrobiella samhällen kom att bli ett citat klassiker i Soil Biology & Biochemistry 24. Forskarna utnyttjade principalkomponentanalys i sin databehandling. PLFA analys, som metoden kallas nu genererar stora datamängder och användning av multivariata statistiska metoder för att behandla dessa uppgifter var mycket innovativt för tid och inspirerande för många. Samtidigt till det arbete som görs i Sverige, ändringar av PLFA förfarandet har undersöks iTyskland av Zelles och kollegor 25-26. Deras version av förfarandet var känd för sin användning av en fast-fas extraktion (SPE) kolumn i stället för kiselsyrakolonn, men totalt sett var mer laboratorium intensiv.
Frostegård papper 23, tillsammans med den detaljerade metod av White & Ringelberg 27, under förutsättning att grunden för en explosion i användningen av PLFA teknik för att undersöka grundläggande frågor i markvetenskap. Sedan dess har ytterligare förbättringar av den metod Firestone och kollegor ingår sätta en intern GC standard (C10: 0) och C19: 0 som ett surrogat standard för att förbättra kvantifiering 28, och ersätta användningen av separations kanaler för rundflaskor för att förenkla extraktion 29. På senare tid, Chowdhury och Dick 30 undersökte metylering steg och rapporterade att de två metyleringsförfaranden används i marken vetenskaplig litteratur KOH / MeOH metod identified ett större utbud av fettsyror.
Denna metod bygger till stor del på den ursprungliga metod som utvecklats av Bligh och Dyer, och innehåller de ändringar som nämns ovan, såsom användning av metanol KOH för metylering steget. Två standarder används för varje prov: en surrogat standard 1,2-dinonadecanoyl–sn-glycero-3-fosfokolin (PC (19: 0/19: 0)), som läggs till jordprovet före den första extraktionen att bedöma effektiviteten och återvinning av hela protokollet, och en instrumentstandard metyl dekanoat (MeC10: 0), som tillsätts före identifiering och kvantifiering av GC.
Vi erkänner att PLFA metod används ofta av många mikrobiell ekologi laboratorier över hela världen, och har dokumenterats flera gånger, bland annat genom den internationella standardiseringsorganisationen 2. Syftet med detta dokument är att presentera en enkel att följa och robust protokoll som kan vara till nytta för jordforskare som försöker att lära sig PLFA teknik.
För att minimera och undvika feltolkning av PLFA data måste noggrann uppgifter screening göras eftersom vissa PLFAs som finns i jorden mikrobiella samhället är också närvarande i enkla och flercelliga eukaryota organismer, såsom växtrötter, alger och markdjur. Dessutom behöver Archaea innehåller inte PLFAs; istället sänds archaeal membran bestående av fosfolipid eterlipider (PLELs). Följaktligen kan PLFA protokollet inte användas för att karakterisera archaeal samhällen i jord.
Associera enskilda PLFAs till specifika mikrobiella grupper bör göras med försiktighet (se 2011 års publicering av Frostegård och kollegor 34 för en utmärkt diskussion av några av begränsningarna i PLFA metoden). I stället kan det vara mer lämpligt, som gjordes i figur 2, att gruppera PLFAs baserat på sin kemiska struktur, till exempel, i) rakkedjiga mättade PLFAs, ii) mättade PLFAs med mitten av chain (10-metyl) förgrenade, iii) terminalt-grenade mättade fettsyror, iv) enkelomättade PLFAs, v) fleromättade PLFAs samt vi) hydroxifettsyror.
Prowikt kan behöva justeras baserat på mängden extraherbara PLFAs ingår i ett givet jordprov. Genom att inte justera mängden jord utvinns i mindre mikrobiellt aktiva jordar användare riskerar att inte få tillräckligt många PLFA svar (toppar) att korrekt representera den totala mikrobiella. I starkt mikrobiellt aktiva jordar med höga koncentrationer av PLFAs användare löper risk för överbelastning av GC-kolonnen och därigenom förhindra korrekt kvantifiering av PLFAs. I båda fallen jordprover måste analyseras på nytt för PLFAs. En bra utgångspunkt är att lägga till 0,5 g för organiska jordprover (såsom skogs våningar), och ca 3 g under mineraljordprover. Eftersom mängden extraherbara PLFAs typiskt korrelerad till mängden organiskt kol som ingår i en jord, prov viight kan justeras baserat på innehåll av kol i marken, till exempel, kan en g mineraljordprov vara tillräcklig för att få en bra PLFA kvantifiering när kolhalten är 10-15%, medan> 5 g kan vara nödvändigt om kolhalten är ≤ 0,5 %. Det är alltid en bra idé att göra en provkörning med några prover för att optimera prowikt innan hela uppsättningen körs.
Vanliga felsöknings strategier för PLFA protokoll och GC-analys är som följer. Om GC kromatogram baslinjen är för hög, bör H2 gascylinder ändras. Om lösningsmedlet eller ISTD toppar saknas i kromatogrammet, kan det finnas ett problem med provinjektion (t.ex. ansluten spruta, problem med autosampler, tom eller saknas flaska, fel med flaskan positionering). Om fler än tre toppar detekteras i metoden / prov tomt, det finns kontamination av blankprovet, och det finns en hög sannolikhet för att ett visst främmande ämne (er) kommer att vara närvarande i provet GC chromatograms. Hitta smittkällan (vanligtvis vattenbaserat medium), eller åtminstone se till att de toppar som motsvarar föroreningen avlägsnas från prov kromatogram och att dessa toppar inte ingår i någon statistisk analys av de PLFA data. Dessutom är det en bra idé att köra hexan sköljer mellan prov vid misstanke överföring är. Ytterligare toppar i hexan sköljningen kommer att indikera överföring (dvs tyngre komponenter eluerades från föregående körning).
Lipider är särskilt känsliga för oxidation, och särskild försiktighet måste iakttas under protokollet för att skydda proverna från luft och ljusexponering, såsom att lagra dem i mörkret och hålla dem under kväve. Alla prover och ämnen måste ha tillräcklig C19: 0 surrogat standard. En saknad C19: 0 topp, antingen prov eller ämnen, indikerar en dålig återhämtning eller en total förlust av analyter. Ett svar av C19: 0 i proverna som är betydligt lägre än den metod / provämnen indikerar en förlust av analyter vid något tillfälle i PLFA metoden. När man står inför dålig C19: 0 återhämtning, alla aspekter av förfarandet måste övervägas noga och undersökte bland annat inledande extraktion, alla stadier av provöverförings, SPE, fettsyra metylering, torkning, förvaring och prov manipulation för att isolera stadium eller stadier där analyter förlorade. Å andra sidan kan det vara så att utvinningen av vissa jordprover kan ge C19: 0, i vilket fall återvinning av surrogat standarden kan överskattas. När du använder två standarder ((PC (19: 0/19: 0) och MeC10: 0) är inte ett absolut krav, vi har funnit att det är mycket användbart när man behöver felsöka Så länge MeC10. 0 svar är tillräckligt kan felsökning fokusera på trappan före GC-analys.
Som tidigare nämnts, måste försiktighet iakttas vid tolkningen ekologisk betydelse och ekosystem relationer baserade enbart på biomarkörer härledad från PLFA data eftersom rena kulturstudier visar att isolerade bakteriestammar kommer att innehålla olika typer av PLFAs. I stället bör biomarkörer PLFAs ses som ett värdefullt tillägg i en svit av bevis när man gör bredare ekologiska slutsatser. I litteraturen har enskilda PLFAs föreslagits och används som biomarkörer för olika mikrobiella grupper. Mättade PLFAs används typiskt för att representera grampositiva bakterier och monoomättade PLFA används för gramnegativa bakterier. Erkända biomarkörer för gramnegativa bakterier innefattar mono-omättade fettsyror med omättnaden vid ω5 eller ω7 läge t.ex. C16: 1ω7, C18: 1ω7, och C18: 1ω5. Dessutom kan cyklopropyl fettsyror också vara representativa för gramnegativa bakterier 35. Därför kan PLFAs från gramnegativa bakterier beräknas vara lika med summan av A: 1ω5 + A: 1ω7 + A: 0cyclo. Erkända biomarkörer för grampositiva bakterier är terminalt förgrenade saturated fettsyror, iso-grenade såsom C15: 0i, C16: 0i, C17: 0i; eller Anteiso förgrenat, såsom C15: 0a och C17: 0a. Mättad PLFAs med mitten av kedjan (10-metyl) förgrening, såsom 10Me16: 0 och 10Me18: 0 är karakteristiskt närvarande i aktinomyceter 36. Således kan PLFAs från grampositiva bakterier att beräknas som lika med summan av A: 0 (ISO, Anteiso, 10-metyl).
Många biomarkörer i samband med svamp PLFA ofta fleromättade, men vissa svamp biomarkörer är enkelomättade. Till exempel, i termer av svamp enkelomättade biomarkörer, C16: 1ω5 har identifierats som en indikator på arbuskulära mykorrhizasvampar (AMF) 37, C18: 1ω9 är vanligt i saprofytiska svampar och ektomykorrhiza innehåller typiskt C16: 1ω9. Närvaron av di-omättade C18: 2ω6,9 inträffar ofta i samband med C18: 1ω9 och även korrelerar väl med det fungala sterol ergosterol, vilket tyder på att C18: 2ω6,9 kan adekvat sätt representera ectomycorrhizae och saprofytiska svampar 38. Tri-omättade C18: 3ω 6,9,12 har också använts som en biomarkör för svampar 10; dock C18: kan 3ω6c hittas i andra eukaryota organismer, inklusive växter och alger, även om det är normalt inte hittas i bakterier. På sikt av jord protists, C20: har 4ω6c erkänts som en protist biomarkör 39, även om annat arbete misslyckats med att upptäcka C20: 4ω6c även när livskraftiga protist populationer bekräftades visuellt med ljusmikroskop 40.
Många studier adress ekologiska frågor som rör den totala markmikrobiella genom att använda multivariata samordningsmetoder som PLFA dataanalys verktyg. Vid användning av denna metod har vissa författare valt att utesluta sällsynta PLFAs från datamängden genom att ta bort PLFAs som förekommer i mindre än 5% av proverna 4. De normala mättade C16: 0 och C18: 0 finns rikligt i alla mark mikroorganismer, inklusive prokaryoter och EUKaryotes. Därför vissa forskare väljer att ta bort dessa PLFAs före statistisk analys på grund av att de inte kan vara känsliga indikatorer på sammansättningen av jorden mikrobiella – även C16: 0 och C18: 0 återstår att inkluderas när summera alla PLFAs för ett index på mikrobiell biomassa. På sikt av statistiska analyser, många forskare väljer att genomföra en icke-metrisk multidimensionell skalning (NMDS) samordning som denna teknik är väl lämpad för uppgifter som inte får vara normalfördelad 33. Ytterligare analyser i samband med kategoriska variabler kan inkludera indikatorarter analys, som kan relatera förekomsten av specifika PLFAs till kategoriska grupperingar och multi svar permutation förfaranden (MRPP), vilket kan bidra till att avgöra likheter eller skillnader mellan mikrobiella samhällen tilldelats kategoriska grupper. Dessutom kan multivariata regressionsträd (MRT) vara särskilt användbart när påverkan av flera experimentella variabler ellerbehandlingar måste bedömas som potentiella förklaringsvariabler 5 (t.ex. markens struktur, fukt, återvinning ålder).
När etablerade, är PLFA protokoll en relativt enkel analysmetod som kan vara mycket användbart när kvantifiering av markmikrobiella svar på miljöförändringar och antropogena störningar. Även molekylära tekniker såsom genetiska fingeravtryck är bättre lämpade för detaljerad beskrivning av mikrobiella samhällen, presenterar PLFA metoden fördelen att den ger kvantitativ information om total mikrobiell biomassa 34. I vår forskningslaboratorium, kan en person bekvämt bearbeta en uppsättning av 20 prover under 4 dagar, och vi har funnit det protokoll som presenteras här att vara ett robust och reproducerbar teknik för att bedöma markens biologiska kvalitet.
Kraften i PLFA metoden kan betydligt längre genom att koppla den till en stabil isotopanalys 41, 42. Specifikt tillägg of 13 C-märkta substrat mot marken möjliggör kvantifiering av substrat införlivande i jord mikroorganismer men isotopanalys av enskilda PLFAs 41. Dessutom verkar den här metoden för att vara en mycket lovande verktyg för att belysa trofiska länkar i marken näringsvävar 42.
The authors have nothing to disclose.
This work was financed in part by the Natural Sciences and Engineering Council of Canada. The authors acknowledge Jela Burkus, Donna Macey, and Jennifer Lloyd for their technical expertise and their contribution to the optimization of this method.
Pierce Reacti-Vap III-evaporator gassing manifold with 27 ports | Used in Steps 1-3 | ||
Compressed Nitrogen | Praxair | Ni-T | Dangerous: Use only after training and minimize contact and use; Used in Steps 1-3 |
Disposable centrifuge tube and Teflon-lined cap | Fisher Scientific | 05-569-3 | Used for Step 1 (1 per sample) and Step 2 (1 per sample) |
Disposable glass long-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | Used for Step 1 (2 per sample) |
Disposable glass short-necked Pasteur pipettes | Fisher Scientific | 13-678-4 | Used for Step 2 (1 per sample), Step 3 (1 per sample), GC analysis (1 per sample),, and one for each type of solution dispensed during PLFA methods (~10 per batch of samples) |
Elastic band | Grand & Toy | 42199 | 1 per sample for freeze drying |
Freeze Dryer-Labconco 7806002 and 7753000 | Used for preparing samples for PLFA analysis – use whatever model your lab has | ||
Freezer (-20 °C, -80 °C) | Revco | ULT2586-5-A36 | Minus 80 °C is used for freezing freshly collected soil samples, -20 °C is used for storing samples at end of each of 3 steps of PLFA analysis |
Gas chromatograph – Agilent 6890 Series capillary gas chromatograph (GC;, Wilmington, DE) equipped with a 50 m Ultra 2 (5%-phenyl)-methylpolysiloxane column | Agilent Technologies | Used for GC analysis, other models of GC could also be used (1 needed) | |
Analytical column | Agilent Technologies | 19091B-105 | |
Gas chromatograph insert | Agilent Technologies | 5183-4692 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Gas chromatograph vial and lid | Agilent Technologies | 5188-6592 | Used for GC analysis (1 per sample) |
Hexanes | Fisher Scientific | H292-4 | Hazardous: use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 4 ml (2.0 ml + 2.0 ml (step 3) |
Hot water bath -Isotemp 220 | Fisher Scientific | Used for Step 3 (1 per batch of samples) | |
Kimwipe | Fisher Scientific | 06-666-2 | Used for freeze drying samples |
KOH, ACS grade | Fisher Scientific | P250-500 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Used for making citrate buffer (used in Step 1) and methanolic KOH (step 3) |
Lab quake end-over-end shaker for centrifuge tubes | Barnstead/Thermolyne | 3,625,485 | Used for Step 1 (1 per batch of samples of appropriate holding capacity) |
MeC10:0 methyl decanoate internal standard | Sigma-Aldrich | 299030-2.5G | Used for GC analysis |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | Hazardous: Use only in fume hood, Read MSDS, minimize use and wear appropriate PPE; Total volume per sample = 15.5 ml (5 ml + 5 ml (step 1) + 5 ml (step 2) + 0.5 ml (step 3)) |
MIDI Peak Identification Software | MIDI, Inc., Newark, DE | Used for interpreting GC analysis output | |
MIDI Calibration Standard Mix for Microbial Identification System | Lab Sphere Inc | 1200-A | Used as a Calibration mix for TSBA 40 |
Nitrile gloves | Fisher Scientific | 27-058-52 | Used always when conducting PLFA lab work |
pH Meter – Accumet XL200 | Fisher Scientific | Used for making citrate buffer | |
Pipette (0.2 – 2 ml)- Socorex -Calibra Digital 832 Macropipette | Socorex | 832.02 | Used throughout Steps (1 per sample) |
250 µL gastight syringe | Hamilton | 1725 | Used for GC analysis (1 per sample) |
silver shield gloves | Sigma-Aldrich | Z529575 | For use when handling chloroform |
solid phase extraction (SPE) column | Agilent Technologies | 5982-2265 | Used for Step 2 (1 per sample) |
SPE glass column holder with spigots and vacuum apparatus attached | Sigma-Aldrich | Used for Step 2 (1 per batch of samples) | |
Vortex – Barnstead International Maxi Mix II- M37615 | Barnstead International | M37615 | Used in Steps 1-3 |
Water - ultra-pure and Chromosolv HPLC grade | Sigma-Aldrich | 270733-4L | Used throughout analysis |
Whirl-Pak® bags | Fisher Scientific | 01-812-120 | Used in sample collection – 2 bags required per sample collected |