Purificación de Complejos nativo para el estudio estructural se utiliza un método Tag Tandem Affinity
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
enfoques de purificación por afinidad han tenido éxito en el aislamiento de los complejos nativos para la caracterización proteómica. La heterogeneidad estructural y un grado de heterogeneidad de composición de un complejo por lo general no impiden el progreso en la realización de dichos estudios. En contraste, un complejo destinado a la caracterización estructural debe ser purificado en un estado que es a la vez de composición y estructuralmente homogéneo, así como a una concentración mayor que la requerida para la proteómica. Recientemente, se han producido avances significativos en la aplicación de la microscopía de electrones para la determinación de la estructura de grandes complejos macromoleculares. Esto ha aumentado el interés en los enfoques para purificar complejos nativas de calidad y cantidad suficiente para la determinación estructural mediante microscopía electrónica. El método de purificación de afinidad en tándem (TAP) ha sido optimizado para extraer y purificar un joven de 18 subunidad, ~ 0,8 ensamblaje ribonucleoproteína MDA a partir de levadura en ciernes (Saccharomyces cerevisiae) </em> adecuado para la tinción negativa y microscopía electrónica de crio. En este documento se detalla las modificaciones introducidas en el método TAP, la justificación para hacer estos cambios, y los enfoques adoptados para el ensayo de un complejo de composición homogénea y estructuralmente.
Introduction
Muchos de los principales procesos celulares se llevan a cabo por gran proteína y proteína-ARN complejos 1. Un cuello de botella significativo para la realización de estudios biofísicos y estructurales de tales complejos de ellos es la obtención de una calidad adecuada (es decir, homogeneidad) y a una concentración apropiada. El aislamiento de un complejo de una fuente nativa tiene muchas ventajas, incluyendo la retención de las modificaciones post-transcripcionales y / o traduccionales relevantes de subunidades y asegurar complejo montaje adecuado. Sin embargo, grandes complejos celulares están a menudo presentes en una célula en un bajo número de copias y la purificación deben ser altamente eficiente y producir en condiciones fisiológicas cerca para asegurar que se mantiene la integridad del complejo. La purificación de un complejo de una fuente eucariota es particularmente difícil y puede ser económicamente prohibitivo. Por lo tanto, es muy deseada estrategias o métodos que sean eficientes y producen un complejo homogéneo.
Una estrategia que ha sidoéxito en la purificación de los complejos nativos de células eucariotas para su caracterización inicial es el tándem de purificación de afinidad (TAP) Método de 2,3. El método TAP fue ideado inicialmente para purificar una proteína nativa de la levadura en ciernes (S. cerevisiae) en el complejo con la interacción de los factores (s) 2. El método TAP utiliza dos etiquetas, cada etiqueta fusionado en tándem para la misma secuencia del gen codificante de la proteína. Las etiquetas fueron seleccionados a fin de equilibrar la necesidad de apretado y selectiva la unión a una resina de afinidad con un deseo de mantener cerca de las condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. La etiqueta TAP genómicamente incorporada se coloca en el extremo (C-terminal) de un gen que codifica la proteína y consistía en una secuencia que codifica para un calmodulina de unión al péptido (CBP) seguido de proteína A – una adición de un poco más de 20 kDa a la etiquetado proteína. CBP es corta, 26 aminoácidos, y reconocidos por el ~ 17 kDa proteína calmodulina (CaM) en presencia de calcio con una K D del orden de 10 -9 M 4. La etiqueta de la proteína A es más grande, que consiste en dos repeticiones de 58 residuos con un enlazador corto entre las repeticiones. Cada repetición de 58 aminoácidos es reconocido por la inmunoglobulina G (IgG) con una K D ~ 10 -8 M 5. Entre estas dos etiquetas se incorporó un sitio de reconocimiento para la proteasa TEV, una endopeptidasa de la Virus del grabado del tabaco 6,7. Como se ilustra en la Figura 1, en la primera etapa de afinidad del método de la TAP proteína marcada se une a una resina de IgG a través de la proteína A. La proteína marcada se eluye por escisión en la columna tras la adición de la proteasa TEV, específicamente en el sitio de escisión entre las dos etiquetas. Este es un paso necesario como la interacción de IgG y proteína A es muy fuerte y sólo puede ser perturbado adecuadamente bajo condiciones de solución de desnaturalización. A falta de un PrOtein Una etiqueta, la proteína se une a la resina de CaM en presencia de calcio y se eluyó de esta resina con adición de EGTA el quelante de iones metálicos (ácido etilen glicol) (Figura 1).
Poco después de la introducción del método de TAP, que se utilizó en un estudio a gran escala para generar un "mapa" de las interacciones complejas en S. 8 cerevisiae. Es importante destacar que, como consecuencia de este esfuerzo una biblioteca entera del marco de levadura-TAP Tagged de lectura abierto (ORF), así como TAP individuo etiquetado ORFs 9 están disponibles de una fuente comercial. Por lo tanto, se puede obtener cualquier cepa de levadura con una proteína etiquetada para cualquier complejo de levadura. El método TAP también estimuló modificaciones o variaciones de la etiqueta TAP, incluyendo: su uso para la purificación de complejos de otros eucariotas, así como células bacterianas 10,11; el diseño de una "etiqueta dividir", en el que la proteína A y CBP se colocan en diferentes proteínas de 12; y la tags cambiado, así como para dar cabida a la necesidad del investigador, tales como la sensibilidad del complejo de Ca 2+ o EGTA 13.
Los recientes avances, tanto en instrumentación y metodología han dado lugar a avances significativos en la aplicación de la microscopía electrónica (EM) para la determinación de la estructura, que han conducido a alta, cerca de imágenes de resolución atómica de complejos macromoleculares 14. La resolución obtenible de un complejo por EM, sin embargo, sigue dependiendo de la calidad del complejo en estudio. En este estudio se ha utilizado la estrategia de etiquetas de TAP para purificar a partir de S. cerevisiae U1 snRNP, un joven de 18 subunidad (~ 0,8 MDA) bajo número de copias ribonucleoprotein complejo que forma parte de la spliceosome 15,16. Una serie de medidas se han adoptado para purificar este complejo tal que es homogéneo y de una concentración adecuada. Los problemas potenciales encontrados en diversas etapas de la purificación se describen y estrategias adoptadas para superar challEnges resaltados. Mediante la evaluación y optimización de las operaciones en la purificación cuidado, el U1 snRNP purificada es de una calidad y en cantidad adecuada para la tinción negativa y crio (crio-EM) los estudios de microscopía de electrones. Un protocolo TAP método optimizado para la purificación de complejos nativas para estudios estructurales se describe en este documento.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método TAP utiliza dos etiquetas que equilibren la necesidad de más rigurosa y selectiva la unión a una resina de afinidad con el deseo de mantener cerca de condiciones de solución fisiológica. Este equilibrio sirve para preservar la interacción estable (s) de la proteína de la etiqueta con el factor de interacción (s) para la caracterización posterior a la purificación. Además, TAP individuo etiquetada ORFs están disponibles de una fuente comercial, de modo que se puede obtener cualquier cepa de levadura…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
