تنقية مجمعات الأصلية للدراسة الهيكلية باستخدام طريقة العلامة جنبا الى جنب الانجذاب
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
وقد نهج تنقية تقارب ناجح في عزل المجمعات المحلية لتوصيف البروتين. عدم التجانس الهيكلي ودرجة من التجانس التركيبي مجمع عادة لا تعيق التقدم في إجراء مثل هذه الدراسات. في المقابل، مجمع مخصص للتوصيف الهيكلية يجب تنقيته في الدولة التي هي على حد سواء بشكل إنشائي ومتجانسة من الناحية الهيكلية وكذلك بتركيز أعلى من اللازم لالبروتينات. في الآونة الأخيرة، كانت هناك تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني لتحديد هيكل المجمعات الجزيئات الكبيرة. زاد هذا الاهتمام في نهج مجمعات تنقي الأم ذات نوعية كافية وكمية من أجل تقرير الهيكلي بواسطة المجهر الإلكتروني. وقد تم تحسين (وات) طريقة جنبا الى جنب الانجذاب تنقية لاستخراج وتنقية وسيلة فرعية 18، ~ 0.8 نجمة داود الحمراء بروتين نووي ريبوزي التجمع من مهدها الخميرة (خميرة الخباز) </م> مناسبة للوصمة عار السلبية والمجهري البرد الإلكترون. هنا هو مفصل التعديلات التي أدخلت على طريقة الحنفية، والأساس المنطقي لإجراء هذه التغييرات، والنهج اتخاذها لفحص لمجمع متجانسة بشكل إنشائي وهيكليا.
Introduction
يتم تنفيذ العديد من العمليات الخلوية الرئيسية من قبل البروتين كبير والبروتين RNA مجمعات 1. واختناق كبير لإجراء دراسات الفيزيائية الحيوية والهيكلية لهذه المجمعات هو الحصول عليها من نوعية مناسبة (أي تجانس) وبتركيز مناسب. عزل مجمع من مصدر الأصلي يحتوي على العديد من المزايا، بما في ذلك الاحتفاظ التعديلات بعد النسخي و / أو متعدية ذات الصلة من مفارز وتأمين التجمع معقدة السليم. ومع ذلك، المجمعات الخلوية كبيرة غالبا ما تكون موجودة في خلية في عدد نسخة منخفضة وتنقية يجب أن تكون فعالة للغاية وتحدث في ظل الظروف الفسيولوجية القريب لضمان الحفاظ على سلامة المعقدة. تنقية مجمع من مصدر وحيد الخلية هو تحديا من نوع خاص، ويمكن أن تكون باهظة من الناحية المالية. وهكذا، الاستراتيجيات أو الأساليب التي تتسم بالكفاءة وتسفر عن مجمع متجانسة والمطلوب للغاية.
استراتيجية التي كانتنجحت في تنقية المجمعات الأم من الخلايا حقيقية النواة لتوصيف الأولي هو جنبا الى جنب الانجذاب تنقية (وات) طريقة 2،3. وقد ابتكر طريقة TAP في البداية لتنقية البروتين الأصلي من الخميرة في مهدها (البيرة س) في مجمع مع التفاعل عامل (ق) 2. الطريقة التونسية تستخدم علامات اثنين، كل بطاقة تنصهر فيها جنبا إلى جنب لنفس تسلسل الجينات المكودة للبروتين. وقد تم اختيار العلامات وذلك لتحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. وضعت علامة TAP أدرجت genomically في نهاية (C-النهائي) من الجين تشفير البروتين وتتكون من سلسلة الترميز لكالمودولين ملزم الببتيد (CBP) تليها البروتين أ – إضافة أكثر من مجرد 20 كيلو دالتون إلى الموسومة بروتين. الجمارك وحماية الحدود قصير، 26 والأحماض الأمينية، ومعترف بها من قبل ~ 17 كيلو دالتون بروتين كالمودولين (CAM) في وجود الكالسيوم مع K D بناء على أمر من 10 -9 م 4. العلامة البروتين وأكبر، تتكون من اثنين من يكرر من 58 بقايا مع رابط قصير بين يكرر. ومن المسلم به كل تكرار حمض 58 الأمينية التي كتبها المناعي G (مفتش) مع K D ~ 10 -8 م 5. بين هذه العلامات اثنين تأسست موقع تقديرا لTEV البروتيني، وببتيداز داخلية من فيروس التبغ إحفر 6،7. كما هو موضح في الشكل رقم 1، في خطوة تقارب الأولى من طريقة برنامج المشورة التقنية الموسومة بروتين لا بد أن راتنج مفتش عبر البروتين ألف ومزال البروتين تصفها على عمود الانقسام على إضافة TEV البروتيني، الموقع تحديدا الشق بين العلامات اثنين. هذا هو خطوة ضرورية كما تفاعل مفتش والبروتين وقوي جدا ويمكن إلا أن يكون منزعجا بشكل كاف في ظل تغيير طبيعة الظروف الحل. تفتقر إلى العلاقات العامةotein علامة، لا بد من البروتين لراتنج كاميرا في وجود الكالسيوم ومزال من هذا الراتنج مع إضافة EGTA أيونات المعادن خالب (جلايكول الإثيلين حمض tetraacetic) (الشكل 1).
بعد فترة وجيزة، تم استخدام إدخال طريقة وات في دراسة على نطاق واسع لتوليد "الخريطة" من التفاعلات المعقدة في س. الخباز 8. الأهم من ذلك، نتيجة لهذا الجهد مكتبة بأكمله الخميرة TAP معلم المفتوحة القراءة الإطار (ORF)، وكذلك TAP الفردية الموسومة ORFS متاحة 9 من مصدر تجاري. وهكذا، يمكن للمرء الحصول على أي سلالة الخميرة مع بروتين الموسومة لأي مجمع الخميرة. كما حفزت طريقة TAP تعديلات أو تغيرات العلامة التونسية، بما في ذلك: استخدامه لتنقية المجمعات من حقيقية النواة الأخرى، وكذلك الخلايا البكتيرية 10،11. وتصميم "علامة تقسيم"، حيث أن البروتين ألف والجمارك وحماية الحدود يتم وضعها على البروتينات المختلفة 12؛ وتاتغيرت ع، وذلك لاستيعاب الحاجة للمحقق، مثل الحساسية من المجمع إلى الكالسيوم 2+ أو EGTA 13.
وقد أدت التطورات الحديثة في كل من الأجهزة ومنهجية تقدما كبيرا في تطبيق المجهر الإلكتروني (EM) لتحديد هيكل، التي أدت إلى الأعلى، بالقرب الصور ذات الدقة الذرية المجمعات الجزيئات 14. القرار الذي يمكن الحصول عليه من مجمع كتبها EM، ومع ذلك، لا يزال يتوقف على نوعية المجمع قيد الدراسة. وقد استخدمت هذه الدراسة المنهج العلامة التونسية لتنقية من س. الخباز وU1 snRNP، من 18 فرعية (~ 0.8 MDA) انخفاض عدد النسخ مجمع بروتين نووي ريبوزي التي هي جزء من التضفير 15،16. وقد تم اتخاذ عدد من الخطوات لتنقية هذا المجمع بحيث متجانسة وذات تركيز كاف. ووصف المشاكل المحتملة التي تواجهها في مختلف مراحل تنقية واستراتيجيات إجراءات للتصدي challأبرزت enges. من خلال تقييم بعناية والاستفادة المثلى من الخطوات في تنقية، تنقية U1 snRNP هو من نوعية وكمية في مناسبة لوصمة عار السلبية والإلكترون المجهري البرد (البرد EM) الدراسات. يوصف بروتوكول طريقة TAP الأمثل لتنقية المجمعات الأم للدراسات الهيكلية هنا.
Protocol
Representative Results
Discussion
الطريقة التونسية تستخدم علامات اللذين تحقيق التوازن بين الحاجة إلى ضيق وانتقائية ملزمة لراتنج تقارب مع الرغبة في الحفاظ على قرب شروط حل الفسيولوجية. ويقدم التوازن للحفاظ على التفاعل مستقر (ق) من البروتين ذات الكلمات الدلالية مع التفاعل عامل (ق) لتوصيف ما بعد تنقية. و?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
