Zuivering van Inheemse Complexen voor de structurele studie Met behulp van een Tandem Affinity Tag Method
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affiniteit zuivering benaderingen zijn succesvol in het isoleren van inheemse complexen voor proteomics karakterisering geweest. Structurele heterogeniteit en een mate van heterogeniteit samenstelling van een complex meestal niet belemmeren vooruitgang bij het uitvoeren van dergelijke studies. Daarentegen zou een complex bestemd voor structurele karakterisering worden gezuiverd in een staat die zowel qua samenstelling en structureel homogeen en bij een hogere concentratie dan vereist voor proteomics. Recent zijn er aanzienlijke vooruitgang bij de toepassing van elektronenmicroscopie voor structuurbepaling van grote macromoleculaire complexen zijn. Dit heeft interesse in benaderingen verhoogde inheemse complexen van voldoende kwaliteit en kwantiteit voor structurele bepaling te zuiveren door elektronenmicroscopie. De Tandem Affinity Purification (TAP) methode is geoptimaliseerd te extraheren en te zuiveren een 18-subunit, ~ 0,8 MDa ribonucleoprotein assemblage uit gist (Saccharomyces cerevisiae) </em> geschikt voor negatieve vlek en elektronenmicroscopie cryo-microscopie. Hierin wordt beschreven de wijzigingen aan de TAP-methode, de reden voor het maken van deze veranderingen, en de aanpak om te testen op een compositorisch en structureel homogeen complex.
Introduction
Veel grote cellulaire processen worden uitgevoerd door grote eiwit en eiwit-RNA-complexen 1 uitgevoerd. Een belangrijk knelpunt te voeren biochemische en structurele studies van zulke complexen te verkrijgen van een geschikte kwaliteit (dwz homogeniteit) en bij een geschikte concentratie. Het isoleren van een complex van een natieve bron heeft vele voordelen, waaronder behoud relevante post-transcriptionele en / of translationele modificaties van subeenheden en verzekeren goede complex samenstel. Echter grote cellulaire complexen zijn vaak aanwezig in een cel op een klein aantal kopieën en de zuivering zeer efficiënt moeten zijn en optreden onder fysiologische omstandigheden omgeving te waarborgen complex behouden blijft. Zuiveren van een complex van een eukaryote bron is bijzonder uitdagend en financieel kan worden onbetaalbaar. Zo strategieën of methoden die efficiënt zijn en leveren een homogeen complex zijn zeer gewenst.
Een strategie die issuccesvol in het zuiveren van inheemse complexen van eukaryote cellen voor hun eerste karakterisering is de Tandem Affinity Purification (TAP) methode 2,3. TAP methode werd aanvankelijk ontwikkeld met een natief eiwit van gist (S. cerevisiae) zuiveren complex samenwerkende factor (en) 2. TAP methode gebruikt twee labels, elke tag gefuseerd in tandem om hetzelfde eiwit coderende gensequentie. De labels werden geselecteerd om een behoefte voor kleine en selectieve binding aan een affiniteitshars met actieve handhaven dichtbij fysiologische oplossing in evenwicht te brengen. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Het genomisch opgenomen TAP tag aan het uiteinde (C-eindstandige) van een eiwit coderend gen en bestond uit een sequentie die codeert voor een calmoduline-bindend peptide (CBP), gevolgd door Proteïne A – toevoeging van iets meer dan 20 kDa gelabelde eiwit. CBP is kort, 26 aminozuren, en door de ~ 17 kDa eiwit calmoduline (CaM) in aanwezigheid van calcium met een Ko in de orde van 10 -9 M 4. De Proteïne A tag groter is, bestaande uit twee herhalingen van 58 residuen met een korte linker tussen de herhalingen. Elke 58 aminozuur herhaling is erkend door immunoglobuline G (IgG) met een K D ~ 10 -8 M 5. Tussen deze twee labels werd opgenomen een erkenning site voor TEV protease, een endopeptidase van de Tobacco Etch Virus 6,7. Zoals weergegeven in figuur 1, in de eerste affiniteit stap van de werkwijze de TAP gelabeld eiwit gebonden aan een IgG hars via de Proteïne A. De toegevoegde eiwit wordt geëlueerd door op de kolom splitsing na toevoeging van TEV protease, plaatsspecifiek splitsen tussen de twee labels. Dit is een noodzakelijke stap de interactie van IgG en proteïne A is zeer sterk en kan alleen voldoende worden verstoord onder denaturerende oplossingsomstandigheden. Bij gebrek aan een Protein Een tag wordt het eiwit gebonden CaM hars in aanwezigheid van calcium en geëlueerd uit de hars met toevoeging van het metaalion chelerende EGTA (ethyleenglycol-azijnzuur) (figuur 1).
Kort na de invoering van de TAP methode werd in een grootschalig onderzoek gebruikt voor het genereren van een "kaart" van complexe interacties in S. 8 cerevisiae. Belangrijker, als gevolg van deze inspanningen een volledige gist-TAP Tagged open leeskader (ORF) bibliotheek en individuele TAP hebben ORFs 9 kunnen van een commerciële bron. Aldus kan men elke giststam met een gemerkt eiwit voor gist complex te verkrijgen. TAP methode spoorde ook wijzigingen of variaties van de TAP tag, zoals: het gebruik ervan voor de zuivering van complexen uit andere eukaryote evenals bacteriële cellen 10,11; het ontwerp van een "split tag", waarbij het Proteïne A en CBP op verschillende eiwitten 12 worden geplaatst; en de tags veranderd, zodat de noodzaak van de onderzoeker accommoderen, zoals gevoeligheid van het complex Ca2 + of EGTA 13.
Recente ontwikkelingen in zowel instrumentatie en werkwijze hebben geleid tot significante vooruitgang in de toepassing van elektronenmicroscopie (EM) voor structuurbepaling, die hebben geleid tot een hoge, bij atomaire resolutie beelden van macromoleculaire complexen 14. De resolutie verkrijgen van een complex met EM blijft echter afhankelijk van de kwaliteit van het complex onder studie. Deze studie heeft de TAP tag aanpak te zuiveren van S. benut cerevisiae U1 snRNP, een 18-subeenheid (~ 0,8 MDa) laag kopieaantal ribonucleoproteïnecomplex die deel uitmaakt van de spliceosome 15,16. Een aantal maatregelen zijn genomen om dit complex zodanig dat het homogeen en voldoende concentratie zuiveren. Potentiële problemen in diverse stadia van de zuiveringswerkwijze zijn beschreven en strategieën genomen chall overwinnenEnges gemarkeerd. Door het zorgvuldig beoordelen en optimaliseren van stappen in de zuivering, de U1 snRNP gezuiverd is van een kwaliteit en tegen een hoeveelheid die geschikt zijn voor negatieve vlek en elektronenmicroscopie cryo-microscopie (cryo-EM) studies. Een geoptimaliseerde TAP methode protocol voor de zuivering van inheemse complexen voor structurele studies wordt hierin beschreven.
Protocol
Representative Results
Discussion
De TAP-methode maakt gebruik van twee tags die een behoefte in evenwicht te brengen voor kleine en selectieve binding aan een affiniteit hars met een verlangen om te handhaven in de buurt van fysiologische oplossing omstandigheden. Dit evenwicht dient stabiele interactie (s) van het gecodeerde eiwit samenwerkende factor (en) voor post-zuivering karakterisering behouden. Tevens is een TAP hebben ORFs zijn verkrijgbaar bij een commerciële bron, zodat men elke giststam te verkrijgen met een gemerkt eiwit voor gist complex…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
