स्ट्रक्चरल अध्ययन एक मिलकर आत्मीयता टैग पद्धति का उपयोग करके मूल निवासी परिसरों की शुद्धि
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
आत्मीयता शुद्धि दृष्टिकोण प्रोटिओमिक लक्षण वर्णन के लिए देशी परिसरों को अलग-थलग करने में सफल रहे हैं। स्ट्रक्चरल विविधता और एक जटिल की compositional विविधता की एक डिग्री आम तौर पर इस तरह के अध्ययन के संचालन में प्रगति में बाधा नहीं है। इसके विपरीत, एक जटिल संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए इरादा एक राज्य है कि दोनों compositionally और संरचनात्मक रूप से सजातीय के साथ ही एक उच्च एकाग्रता प्रोटिओमिक्स के लिए आवश्यकता से कम में शुद्ध किया जाना चाहिए। हाल ही में, वहाँ बड़े macromolecular परिसर की संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के आवेदन में महत्वपूर्ण प्रगति की गई है। यह इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा पर्याप्त गुणवत्ता और संरचनात्मक निर्धारण के लिए मात्रा के देशी परिसरों को शुद्ध करने के दृष्टिकोण में दिलचस्पी बढ़ गई है। अग्रानुक्रम आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि निकालने के लिए और एक 18 सबयूनिट शुद्ध करने के लिए अनुकूलित किया गया है, ~ नवोदित खमीर से 0.8 एमडीए ribonucleoprotein विधानसभा (Saccharomyces cerevisiae) </उन्हें> नकारात्मक दाग और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी क्रायो के लिए उपयुक्त है। इस के साथ साथ नल विधि, इन परिवर्तनों को बनाने के लिए तर्क में किए गए संशोधनों विस्तृत है, और दृष्टिकोण एक compositionally और संरचनात्मक रूप से सजातीय परिसर के लिए परख करने के लिए लिया।
Introduction
कई प्रमुख सेलुलर प्रक्रियाओं बड़े प्रोटीन और प्रोटीन आरएनए परिसरों 1 से बाहर किया जाता है। ऐसे परिसरों की biophysical और संरचनात्मक अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण टोंटी उन्हें एक उपयुक्त गुणवत्ता (यानी, एकरूपता) के और एक उचित एकाग्रता में प्राप्त है। एक देशी स्रोत से एक जटिल अलग यूनिटों की संगत के बाद ट्रांसक्रिप्शनल और / या translational संशोधनों को बनाए रखना है और उचित जटिल विधानसभा बीमा सहित कई फायदे हैं। हालांकि, बड़े सेलुलर परिसरों अक्सर एक कम प्रतिलिपि संख्या में एक सेल में मौजूद हैं और शुद्धि अत्यधिक कुशल हो सकता है और निकट शारीरिक शर्तों के तहत होने जटिल अखंडता को बनाए रखा है सुनिश्चित करने के लिए करना चाहिए। एक यूकेरियोटिक स्रोत से एक जटिल शुद्ध विशेष रूप से चुनौतीपूर्ण है और आर्थिक रूप से निषेधात्मक हो सकता है। इस प्रकार, रणनीति या तरीकों कि कुशल हैं और एक सजातीय जटिल उपज अत्यधिक वांछित हैं।
एक रणनीति है कि कर दिया गया हैउनकी प्रारंभिक लक्षण वर्णन के लिए कोशिकाओं से देशी परिसरों सफ़ाई करने में सफल संगठनों ने मिलकर आत्मीयता शुद्धि (नल) विधि 2,3 है। नल विधि शुरू कारक 2 (एस) बातचीत के साथ परिसर में एक देशी प्रोटीन नवोदित खमीर (एस cerevisiae) से शुद्ध करने के लिए तैयार किया गया था। नल विधि दो टैग, प्रत्येक टैग एक ही प्रोटीन कोडिंग जीन अनुक्रम को मिलकर में जुड़े हुए उपयोग किया। के रूप में इतनी तंग और चयनात्मक शारीरिक समाधान की स्थिति के पास बनाए रखने के लिए एक इच्छा के साथ एक समानता राल के लिए बाध्य करने के लिए एक की जरूरत संतुलन के लिए टैग चयन किया गया था। यह संतुलन के बाद शुद्धि लक्षण वर्णन के लिए कारक (ओं) बातचीत के साथ टैग प्रोटीन की स्थिर बातचीत (ओं) को संरक्षित करने के लिए कार्य करता है। टैग बस पर 20 केडीए के लिए एक अतिरिक्त – genomically शामिल नल टैग अंत में रखा गया था (सी टर्मिनल) एक प्रोटीन कोडिंग जीन की और एक दृश्य एक Calmodulin बाध्यकारी पेप्टाइड (सीबीपी) एक प्रोटीन के द्वारा पीछा के लिए कोडिंग के शामिल प्रोटीन। सीबीपी, कम है 26 अमीनो एसिड होता है, और द्वारा मान्यता प्राप्त ~ 17 केडीए प्रोटीन Calmodulin 10 -9 के आदेश एम 4 पर एक कश्मीर डी के साथ कैल्शियम की उपस्थिति में (सीएएम)। एक प्रोटीन टैग बड़ा दोहराता के बीच एक छोटी लिंकर साथ 58 अवशेषों की दो दोहराता से मिलकर है। प्रत्येक 58 एमिनो एसिड दोहराने एक कश्मीर डी ~ 10 -8 एम 5 के साथ इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी) द्वारा मान्यता प्राप्त है। इन दोनों के बीच टैग TEV प्रोटीज, तम्बाकू खोदना वायरस 6.7 से एक endopeptidase के लिए एक मान्यता साइट शामिल किया गया था। जैसा कि चित्र 1 में सचित्र, विधि नल टैग प्रोटीन की पहली समानता कदम में प्रोटीन ए टैग प्रोटीन TEV प्रोटीज, साइट विशेष के बीच cleaving के अलावा पर स्तंभ दरार पर से eluted है के माध्यम से एक आईजीजी राल के लिए बाध्य है दो टैग। इस आईजीजी की बातचीत के रूप में एक आवश्यक कदम है और एक प्रोटीन बहुत मजबूत है और केवल पर्याप्त रूप से denaturing समाधान की शर्तों के तहत परेशान किया जा सकता है। एक पीआर अभावएक टैग otein, प्रोटीन कैल्शियम की उपस्थिति में सांचा राल के लिए बाध्य और धातु आयन chelator EGTA (एथिलीन ग्लाइकोल tetraacetic एसिड) (चित्रा 1) के अलावा के साथ इस राल से eluted है।
इसके तुरंत बाद नल विधि का परिचय, यह एक बड़े पैमाने पर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया था उत्पन्न करने के लिए एक एस में जटिल संबंधों की 'नक्शा' cerevisiae 8। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रयास को एक पूरे खमीर-नल गईं खुला पढ़ने फ्रेम (ओआरएफ) पुस्तकालय का एक परिणाम के रूप में अच्छी तरह से व्यक्तिगत नल के रूप में चिह्नित ORFs 9 एक वाणिज्यिक स्रोत से उपलब्ध हैं। इस प्रकार, एक किसी भी खमीर परिसर के लिए एक टैग प्रोटीन के साथ किसी भी खमीर तनाव प्राप्त कर सकते हैं। नल विधि भी संशोधन या नल टैग के रूपांतरों सहित प्रेरित: अन्य यूकेरियोटिक के साथ ही बैक्टीरियल कोशिकाओं 10,11 से परिसरों की शुद्धि के लिए इसके उपयोग; एक 'विभाजित टैग ", जिसमें एक प्रोटीन और सीबीपी अलग प्रोटीन 12 पर रखा जाता है की डिजाइन; और टाजी एस, बदल इतनी के रूप में इस तरह के सीए 2 या EGTA 13 करने के लिए जटिल की संवेदनशीलता के रूप में, अन्वेषक की जरूरत को समायोजित करने के लिए।
दोनों इंस्ट्रूमेंटेशन और कार्यप्रणाली में हाल के अग्रिमों संरचना निर्धारण के लिए इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) के आवेदन में उल्लेखनीय प्रगति की है, उस macromolecular परिसर में 14 के परमाणु संकल्प छवियों के पास उच्च करने के लिए नेतृत्व किया है, के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। संकल्प ईएम द्वारा एक परिसर के प्राप्य, हालांकि, अध्ययन के तहत जटिल की गुणवत्ता पर आकस्मिक बनी हुई है। इस अध्ययन में नल टैग दृष्टिकोण एस से शुद्ध करने के लिए उपयोग किया गया है cerevisiae U1 snRNP, एक 18 सबयूनिट (~ 0.8 एमडीए) कम प्रतिलिपि संख्या ribonucleoprotein जटिल है कि spliceosome 15,16 का हिस्सा है। कदम की एक संख्या इस जटिल ऐसी है कि यह सजातीय और एक पर्याप्त एकाग्रता की है शुद्ध करने के लिए उठाए गए हैं। संभावित समस्याओं शुद्धि के विभिन्न चरणों में सामना करना पड़ा वर्णित हैं और रणनीतियों chall पर काबू पाने के लिए लियाenges पर प्रकाश डाला। सावधानी से आकलन करने और शुद्धि के चरणों का अनुकूलन से, U1 snRNP शुद्ध एक गुणवत्ता की और और नकारात्मक दाग के लिए उपयुक्त इलेक्ट्रॉन क्रायो माइक्रोस्कोपी (क्रायो ईएम) के अध्ययन के एक मात्रा में है। संरचनात्मक अध्ययन के लिए देशी परिसरों की शुद्धि के लिए एक अनुकूलित नल विधि प्रोटोकॉल यहाँ बताया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
नल विधि दो टैग कि तंग और चयनात्मक शारीरिक समाधान की स्थिति के पास बनाए रखने के लिए एक इच्छा के साथ एक समानता राल के लिए बाध्य करने के लिए एक की जरूरत के संतुलन का इस्तेमाल करता है। यह संतुलन के बाद शुद्धि …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
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