タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
アフィニティー精製のアプローチはプロテオミクス特性評価用のネイティブ複合体を単離することに成功しています。構造的不均一性との複合体の組成不均一性の程度は、通常、このような研究を行うの進展が妨げられることはありません。これとは対照的に、構造的な特徴付けのために意図された複合体は、両方の組成と構造的に均質なだけでなく、プロテオミクスのために必要とされるよりも高い濃度である状態で、精製されるべきです。近年、大規模な高分子複合体の構造を決意する電子顕微鏡の応用において重要な進歩がありました。これは、電子顕微鏡による構造決意するのに十分な質と量のネイティブの複合体を精製するためのアプローチへの関心を高めています。タンデムアフィニティー精製（TAP）メソッドは18サブユニットを抽出し、精製するために最適化されている、〜出芽酵母から0.8 MDAリボアセンブリ（ サッカロマイセス・セレビシエ） </em>のネガティブ染色および電子クライオ顕微鏡に適しています。ここで、TAP法、これらの変更を行うための理論的根拠、及び組成と構造的に均質な複合体についてアッセイするために撮影したアプローチに加えられた変更を詳述されています。
Introduction
多くの主要な細胞プロセスは、大きなタンパク質およびタンパク質-RNA複合体1によって行われます。このような複合体の生物物理学的および構造的な研究を行うに重大なボトルネックは、適切な品質（ すなわち 、均一性）の、適切な濃度でそれらを得ることです。天然の供給源から複合体を分離することにより、サブユニットの関連する転写後および/または翻訳後修飾を保持し、適切な複雑なアセンブリを保証を含め、多くの利点があります。しかし、大規模な細胞複合体は、低コピー数で、多くの場合、細胞内に存在していると精製は非常に効率的で、複雑な整合性が維持されていることを確認するために近くの生理的条件下で発生する必要があります。真核生物源から複合体を精製することは特に困難であり、財政的に法外することができます。したがって、効率的でかつ均一な複合体をもたらす戦略または方法が非常に望まれています。
されている戦略彼らの初期の特性のために、真核細胞からの天然の複合体を精製することに成功は、タンデムアフィニティー精製（TAP）法2,3です。 TAPの方法は、最初因子（複数可）2相互作用との複合体で出芽酵母（S.セレビシエ）から天然のタンパク質を精製するために考案されました。 TAP法は、同じタンパク質をコードする遺伝子配列をタンデムに融合した各タグを二つのタグを利用しました。タイトかつ選択的な生理学的溶液条件の近くに維持する要望と親和性樹脂に結合するための必要性のバランスを取るように、タグを選択しました。このバランスは、精製後の特徴付けのための因子（単数または複数）の相互作用でタグ付けされたタンパク質の安定な相互作用（複数可）を維持するのに役立ちます。ゲノムに組み込まTAPタグは、タンパク質をコードする遺伝子の末端（C末端）に配置され、プロテインAに続くカルモジュリン結合ペプチド（CBP）のためのシーケンスをコードで構成された – タグを付けたにわずか20キロダルトンの追加タンパク質。 CBPは2、短いです6アミノ酸、および10 -9 M 4のオーダーのK Dとカルシウムの存在下で〜17 kDaのタンパク質カルモジュリン（CAM）によって認識。プロテインAタグは、反復間の短いリンカーを有する58残基二反復からなる、大きくなります。各58アミノ酸反復は、K D〜10 -8 M 5で免疫グロブリンG（IgG）によって認識されます。これら二つのタグの間にTEVプロテアーゼ、タバコエッチウイルス6,7からエンドペプチダーゼの認識部位を組み込みました。 TAPタンパク質をタグ付け方法の第1の親和性ステップにおいて、 図1に示すようにタグ付けされたタンパク質をTEVプロテアーゼ、特にサイト間切断を添加すると、カラム切断にすることによって溶出し、プロテインAを介してIgGを樹脂に結合されています二つのタグ。 IgGおよびプロテインAの相互作用が非常に強く、唯一の適切ソリューションの変性条件下で摂動することができますので、これは必要なステップです。 Prを欠きますタグotein、タンパク質は、カルシウムの存在下カム樹脂に結合され、金属イオンキレート剤EGTA（エチレングリコール四酢酸）（ 図1）を添加して、この樹脂から溶出しました。
すぐTAP法を導入した後、それは、Sで複雑 な相互作用の「マップ」を生成するために、大規模な研究で使用しましたセレビシエ 8。重要なのは、この努力の結果として全体の酵母-TAPタグ付きオープンリーディングフレーム（ORF）ライブラリだけでなく、個々のTAPはのORF 9は商業的供給源から入手可能であるタグ付けされました。このように、1は、任意の酵母複合体のためのタグ付きタンパク質と任意の酵母株を取得することができます。 TAP法も含め、TAPタグの修正または変形に拍車をかけた。他の真核生物からの複合体の精製、ならびに細菌細胞10,11のためのその使用。プロテインAとCBPが異なるタンパク質12上に配置され、「スプリットタグ」のデザイン;そして、TA例えば、Ca 2+またはEGTA 13複合体の感度と、研究者のニーズに適応するようにGSは、変更しました。
器具類および方法論の両方における最近の進歩は、高分子複合体14の原子解像度画像の近くに高につながった構造決意、ための電子顕微鏡（EM）の適用における重要な進歩をもたらしてきました。 EMによる複合体の得られる分解能は、しかし、研究中の複合体の品質次第で残っています。本研究では、Sから精製するために、TAPタグのアプローチを利用していますセレビシエ U1 snRNP、スプライソソーム15,16の一部である18サブユニット（〜0.8 MDA）低コピー数のリボ核タンパク質複合体。ステップ数は、均一で十分な濃度であるように、この複合体を精製するためにとられています。精製の様々な段階で遭遇する潜在的な問題が記載されており、戦略はCHALLを克服するためにとらengesを強調しました。慎重に精製の手順を評価し、最適化することにより、精製されたU1 snRNPは、品質のとネガティブ染色および電子クライオ顕微鏡（クライオEM）の研究に適した量です。構造研究のために、天然の複合体の精製のための最適化されたTAP法プロトコルは、本明細書に記載されています。
Protocol
Representative Results
Discussion
TAP法はタイトで、生理的溶液条件の近くに維持する欲求と親和性樹脂への結合選択性の必要性のバランスをとる二つのタグを利用しています。このバランスは、精製後の特徴付けのための因子（単数または複数）の相互作用でタグ付けされたタンパク質の安定な相互作用（複数可）を維持するのに役立ちます。また、個々のTAPは1つが、任意の酵母複合体のためにタグ付けされたタンパク質?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
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