탠덤 선호도 태그 방법을 사용하여 구조 연구에 대한 기본 공단의 정화
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
선호도 정화 방법은 단백체 특성에 대한 기본 복합체를 분리에 성공했다. 구조 이질성과 단지의 조성 이질성의 정도는 일반적으로 연구를 수행의 진행을 방해하지 않습니다. 반대로, 구조적 특성을위한 복합 구성물은 구조적으로 균일뿐만 아니라 프로테오믹스에 필요한 것보다 더 높은 농도 인 상태에서 정제한다. 최근 큰 거대 분자 복합체의 구조 결정을위한 전자 현미경의 적용에 상당한 발전이 있었다. 이것은 전자 현미경으로 구조 결정을위한 충분한 품질과 양의 천연 복합체를 정제하는 방법에 대한 관심이 높아지고있다. 탠덤 선호도 정화 (TAP) 메소드가 18 서브 유닛을 추출하고 정제 최적화되었습니다 ~ 신진 효모에서 0.8 MDA의 리보 어셈블리 (사카로 마이 세스 세레 비지) </EM> 부정적인 얼룩 및 전자 냉동 현미경에 적합합니다. 여기 TAP 방법, 이러한 변화를 만들기위한 이론적 근거에 대한 수정 사항을 자세히 설명하고, 접근 방식은 구성 상과 구조적으로 균일 복잡한에 대한 분석로 이동합니다.
Introduction
다수의 주요 세포 과정 큰 단백질 및 단백질 RNA 복합체 (1)에 의해 수행된다. 같은 단지의 생물 물리학 및 구조 연구를 수행에 중요한 병목 현상은 적절한 품질 (즉, 균질성)의 적절한 농도를 얻을 수있다. 기본 소스에서 복합체를 분리하는 것은 서브 유닛의 관련 포스트 전사 및 / 또는 번역 후 변형을 유지하고 적절한 복잡한 어셈블리를 보장 등 많은 장점을 가지고 있습니다. 그러나, 큰 세포 복합체는 낮은 카피 수에서 종종 세포에 존재하고 정화는 고도로 효율적인하고 복잡한 무결성을 유지하기 위해 주변의 생리적 조건에서 발생해야합니다. 진핵 소스에서 복잡한 정제 특별히 도전하고 재정적으로 금지 될 수 있습니다. 따라서, 효율적이고 균일 한 복합체를 수득 전략 또는 방법이 매우 바람직하다.
된 전략초기 특성화 진핵 세포에서 네이티브 단지를 정화에 성공적 탠덤 선호도 정화 (TAP) 방법 2,3입니다. 탭 방법은 처음 인자 (들)이 상호 작용하는 복잡한의 신진 효모 (S. cerevisiae의)에서 천연 단백질을 정제하기 위해 고안되었다. 탭 방식은 두 개의 태그, 동일한 단백질을 코딩하는 유전자 서열과 나란히 융합 각 태그를 이용했다. 타이트 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을하도록 태그를 선택 하였다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 태그가 단지 위에 20 kDa의의 부가 – genomically 혼입 TAP 태그 끝에 배치하고, 단백질 – 코딩 유전자 (단말 C)의 단백질 A 뒤에 펩타이드 (CBP)을 바인딩 모듈 린을 코딩하는 서열로 구성된 단백질. CBP는이 짧다(6) 아미노산 및 의해 인식 ~ 17 kDa의 단백질, 칼 모듈 린 10-9 M의 순서 (4)에 K D와 칼슘의 존재 (CAM). 단백질 A는 태그의 반복 사이에 짧은 링커 잔기의 58 개의 반복 이루어진 크다. 각 58 아미노산 반복은 K D ~ 10 -8 M (5) 면역 글로불린 G (IgG의)에 의해 인식된다. 이 두 태그 사이에 TEV 단백질 분해 효소, 담배 엣지 바이러스 6, 7에서 엔도 펩 티다 제에 대한 인식 사이트를 통합했다. 탭 단백질 태그에있어서의 제 연관 단계에서,도 1에 도시 된 바와 같이 태그 단백질 TEV 단백질 분해 효소, 특히 사이트 사이의 절단의 첨가시 열 절단에 의해 용출 된 단백질 A. 통해 IgG의 수지에 바인딩 두 태그입니다. 이것의 IgG의 상호 작용 등의 필요한 단계 및 단백질 A가 매우 강해에만 적절 변성 용액 조건 교란 될 수있다. 홍보 부족태그 otein 단백질은 칼슘의 존재 캠 수지에 결합 된 금속 이온 킬 레이터의 EGTA (에틸렌 글리콜 테트라 산) (도 1)을 첨가하여이 수지로부터 용출시켰다.
탭 방식의 도입은 그것이 생성하는 대규모 연구에 사용 된 바로 후에 S. 복잡한 상호 작용 '맵핑' cerevisiae의 8. 중요한 것은 이러한 노력 전체 효모-TAP 태그 오픈 리딩 프레임 (ORF) 라이브러리의 결과뿐만 아니라 개별 TAP로 (9)는 상용 소스에서 사용할 수 개의 ORF 태그. 따라서, 하나는 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있습니다. 상기 탭 방법도 포함 변형 또는 TAP 태그의 변형 가했다 기타 진핵뿐만 아니라 박테리아 세포 10,11에서 착물 정제의 사용; 단백질 A 및 CBP는 다른 단백질 (12)에 배치되는 것을 특징으로 "분할 태그"의 디자인; 그리고 타예컨대 칼슘 또는 EGTA (13) 복합체의 감도, 연구자의 필요를 수용하도록 GS가 바뀌었다.
모두 계측 및 방법론의 최근 발전은 거대 분자 복합체 (14)의 원자 해상도의 이미지에 가까운 높은 주도 한 구조 결정을위한 전자 현미경 (EM)의 응용 프로그램에서 상당한 진보를 주도하고있다. EM에 의해 복잡 얻어지는 해상도는, 그러나, 연구중인 복합물의 품질을 조건으로 유지된다. 이 연구는 S.에서 정화 할 수있는 TAP 태그 방식을 사용하고있다 cerevisiae의 U1 snRNP는 spliceosome (15, 16)의 일부인 18 서브 유닛 (~ 0.8 MDA) 낮은 사본 번호 리보 복잡한. 다수의 단계는 균일하고 적절한 농도가되도록이 복합체를 정제 취해왔다. 정화의 여러 단계에서 발생하는 잠재적 인 문제를 설명하고 전략 chall을 극복하기 위해 촬영enges는 강조했다. 주의 깊게 평가 및 정제 단계를 최적화함으로써, U1 snRNP 정제 품질의 음의 얼룩에 적합 전자 냉동 현미경 (냉동-EM) 연구 양이다. 구조 연구를위한 기본 복합체의 정제를위한 최적화 된 TAP 방식 프로토콜이 설명된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
탭 방식 꽉 선택적 생리 용액 상태의 가까이 유지하려는 욕구와 친 화성 수지에 결합하기위한 필요성의 균형을 두 개의 태그를 이용한다. 이 균형은 정제 후 특성에 대한 계수 (들)와 상호 작용하는 태깅 된 단백질의 안정한 상호 작용 (들)을 유지하는 역할을한다. 또한, 개별 TAP 한 어떤 효모 복잡한에 대한 태그 단백질과 어떤 효모를 얻을 수 있도록하는 ORF는 상용 소스에서 사용할 수있는 태그. ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
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