Rensing av Native Komplekser for Structural Study Ved hjelp av en Tandem Affinity Tag Method
Summary
The Tandem Affinity Purification (TAP) method has been used extensively to isolate native complexes from cellular extract, primarily eukaryotic, for proteomics. Here, we present a TAP method protocol optimized for purification of native complexes for structural studies.
Abstract
Affinity rensing tilnærminger har vært vellykket i å isolere innfødte komplekser for proteomikk karakterisering. Strukturell heterogenitet og en grad av komposisjons heterogenitet av et komplekst vanligvis ikke til hinder for framgang i å gjennomføre slike studier. I motsetning til dette, bør en kompleks beregnet for strukturell karakterisering renses i en tilstand som er både sammensetningsmessig og strukturelt homogent, så vel som ved en høyere konsentrasjon enn nødvendig for proteomikk. Nylig har det vært betydelige fremskritt i anvendelsen av elektronmikroskopi for strukturbestemmelse av store makromolekylære komplekser. Dette har økt interessen for tilnærminger for å rense innfødte komplekser av tilstrekkelig kvalitet og kvantitet for strukturbestemmelse ved elektronmikroskopi. The Tandem Affinity Rensing (TAP) metoden har blitt optimalisert for å trekke ut og rense en 18-subenhet, ~ 0,8 MDA ribonucleoprotein enheten fra spirende gjær (Saccharomyces cerevisiae) </em> egnet for negative flekken og elektron Cryo mikroskopi. Heri er detaljert endringene som er gjort i TAP-metoden, begrunnelsen for å gjøre disse endringene, og tilnærminger tatt til analyse for en sammensetnings og strukturelt homogent kompleks.
Introduction
Mange store cellulære prosesser blir utført av store protein og protein-RNA komplekser 1. En vesentlig flaskehals for å drive biofysiske og strukturelle studier av slike komplekser er å skaffe dem av et egnet kvalitet (dvs. homogenitet) og i en passende konsentrasjon. Isolere et kompleks fra en innfødt kilde har mange fordeler, blant annet å holde relevante post-transkripsjon og / eller translasjonsforskning modifikasjoner av underenheter og sikrer riktig sammensatt forsamling. Men store cellekomplekser er ofte tilstede i en celle på et lavt kopiantall og rensing må være svært effektiv og forekomme i henhold til i nærheten av fysiologiske betingelser for å sikre at komplekset integritet opprettholdes. Rensing av et kompleks fra en eukaryot kilde er spesielt utfordrende og kan være økonomisk uoverkommelige. Dermed er strategier eller metoder som er effektive og gi et homogent kompleks svært ønsket.
En strategi som har værtvellykket i å rense innfødte komplekser fra eukaryote celler for deres første karakterisering er den Tandem Affinity Rensing (TAP) -metoden 2,3. TAP-metoden ble opprinnelig utviklet for å rense et nativt protein fra den spirende gjær (S. cerevisiae) i kompleks med samspill faktor (e) 2. TAP-metoden benyttes to koder, hver tag smeltet sammen til samme proteinkodende gensekvens. Merkene ble valgt slik at den balanserer et behov for stram og selektiv binding til en affinitet harpiks med et ønske om å opprettholde nær fysiologiske løsnings betingelser. Denne balansen tjener til å opprettholde stabil interaksjon (e) av den merkede protein med samspill faktor (er) for etterrensing karakterisering. Den genomisk innlemmet TAP-tag ble plassert ved enden (C-terminale) av et protein-kodende gen og besto av en sekvens som koder for et Calmodulin Binding peptid (CBP) etterfulgt av Protein A – en tilsetning av i overkant av 20 kDa til den merkede protein. CBP er kort, 26 aminosyrer, og som gjenkjennes av ~ 17 kDa-proteinet Calmodulin (CaM) i nærvær av kalsium med en K D i størrelsesorden av 10 -9 M 4. Protein En kode er større, som består av to rapporter av 58 rester med en kort linker mellom gjentakelser. Hver 58 aminosyre repeat er anerkjent av immunglobulin G (IgG) med en K D ~ 10 -8 M 5. Mellom disse to kodene ble innlemmet et gjenkjenningssete for TEV protease, en endopeptidase fra Tobacco Etch Virus 6,7. Som illustrert i figur 1, i den første affinitet trinn i fremgangsmåten TAP-merkede proteinet er bundet til et IgG-harpiks via protein A. Det merkede proteinet blir eluert ved på kolonne spaltning ved tilsetning av TEV protease, sete-spesifikt spalte mellom de to koder. Dette er et nødvendig skritt som samspillet mellom IgG og Protein A er svært sterk og kan bare være tilstrekkelig opprørt etter denaturerende løsnings forhold. Mangler en Protein A-koden, blir proteinet bundet til CaM harpiks i nærvær av kalsium og eluert fra denne harpiks med tilsetning av metallionet chelateringsmidlet EGTA (etylenglykol-tetraeddiksyre) (figur 1).
Kort tid etter innføringen av TAP-metoden, ble det brukt i en stor undersøkelse for å generere et "kart" av komplekse interaksjoner i S. cerevisiae 8. Viktigere, som en konsekvens av dette arbeidet en hel gjær-TAP Tagged åpen leseramme (ORF) bibliotek samt enkelte TAP tagget ORF 9 er tilgjengelige fra en kommersiell kilde. Dermed kan man oppnå en hvilken som helst gjærstamme med et kodet protein for en hvilken som helst gjær-komplekset. TAP metoden også ansporet modifikasjoner eller variasjoner av TAP tag, inkludert: bruk for rensing av komplekser fra andre eukaryote samt bakterielle celler 10,11; utformingen av en "split tag", karakterisert ved at protein A og CBP er plassert på forskjellige proteiner 12; og tags endret, for derved å imøtekomme behovet for undersøkeren, som for eksempel følsomhet av komplekset til Ca2 + eller EGTA 13.
Nylige fremskritt innen både instrumentering og metodikk har ført til betydelige fremskritt i bruk av elektronmikroskopi (EM) for strukturbestemmelse, som har ført til høy, nær atom oppløsning av makromolekylære komplekser 14. Oppløsningen kan fremskaffes av et kompleks av EM forblir imidlertid betinget av at kvaliteten av komplekset under studien. Denne studien har benyttet TAP tag tilnærming for å rense fra S. cerevisiae U1 snRNP, en 18-subenhet (~ 0,8 MDA) lav kopiantall ribonucleoprotein kompleks som er en del av spliceosome 15,16. Et antall skritt er tatt for å rense dette komplekset slik at det er homogent og av en tilstrekkelig konsentrasjon. Potensielle problemer som oppstår på ulike stadier av rensingen er beskrevet og tatt strategier for å overvinne challEnges uthevet. Ved å nøye vurdere og optimalisere trinn i rensingen, U1 snRNP renset er av en kvalitet og til en mengde som passer for negative flekken og elektron kryo mikroskopi (cryo-EM) undersøkelser. En optimalisert TAP fremgangsmåte protokoll for rensing av innfødte komplekser for strukturelle studier er beskrevet heri.
Protocol
Representative Results
Discussion
TAP metoden benytter to koder som balanserer behovet for stram og selektiv binding til en tilhørighet harpiks med et ønske om å opprettholde nær fysiologiske løsnings forhold. Denne balansen tjener til å opprettholde stabil interaksjon (e) av den merkede protein med samspill faktor (er) for etterrensing karakterisering. I tillegg har enkelte TAP merket ORF er tilgjengelige fra en kommersiell kilde, slik at man kan oppnå en hvilken som helst gjærstamme med et kodet protein for en hvilken som helst gjær-komplekse…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors are grateful for the support and advice of Nikolaus Grigorieff. We thank Anna Loveland, Axel Brilot, Chen Xu, and Mike Rigney for helpful discussions and EM guidance. This work was funded by the National Science Foundation, Award No. 1157892. The Brandeis EM facility is supported by National Institutes of Health grant P01 GM62580.
Materials
| S. cerevisiae TAP tagged strain | Open Biosystems | YSC1177 | This is the primary yeast strain used to develop the TAP protocol. Its background is S288C: ATCC 201388: MATa, his3Δ1, leu2Δ0, met15Δ0, ura3Δ0, SNU71::TAP::HIS3MX6 |
| Coffee grinder | Mr. Coffee | IDS77 | Used for cell lysis |
| Hemocytometer, Bright Line | Hausser Scientific | 3120 | Used to assess cell lysis |
| JA 9.100 centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to harvest the yeast cells | |
| JA 20 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to clear the cell extract of non-soluble cellular material | |
| Ti 60 fixed-angle centrifuge rotor | Beckman Coulter, Inc. | Used to further clear the soluble cell extract | |
| Thermomixer | Eppendorf | R5355 | Temperature controlled shaker |
| Novex gel system | Thermo Fisher Scientific | ||
| IgG resin | GE Healthcare | 17-0969-01 | Sepharose 6 fast flow |
| Calmodulin resin | Agilent Technologies, Inc. | 214303 | Affinity resin |
| Protease inhibitor cocktail, mini tablets | Sigma Aldrich | 589297 | Mini cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Protease inhibitor cocktail, large tablets | Sigma Aldrich | 5892953 | cOmplete ultra EDTA-free tablets |
| Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | Dissolved in isopropanol | ||
| 2 mL Bio-spin column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7326008 | Used to pack and wash the Calmodulin resin |
| 10 mL poly-prep column | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 7311550 | Used to pack and wash the IgG resin |
| Precast native PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | BN1002 | Novex NativePAGE Bis-Tris 4-16% precast polyacrylamide gels |
| NativeMark protein standard | Thermo Fisher Scientific | LC0725 | Unstained protein standard used for native PAGE. Load 7.5 μL for a silver stained gel and 5 μL for a SYPRO Ruby stained gel |
| Precast SDS PAGE Bis-Tris gels | Life Technologies | NP0321 | Novex Nu-PAGE Bis-Tris 4-12% precast polyacrylamide gels |
| PageRuler protein standard | Thermo Fisher Scientific | 26614 | Unstained protein standard used for Western blotting |
| SDS running buffer | Life Technologies | NP0001 | 1x NuPAGE MOPS SDS Buffer |
| TAP antibody | Thermo Fisher Scientific | CAB1001 | Primary antibody against CBP tag |
| Secondary antibody | Thermo Fisher Scientific | 31341 | Goat anti-rabbit alkaline phosphatase conjugated |
| BCIP/NBT | Thermo Fisher Scientific | 34042 | 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate/nitro blue tetrazolium |
| Dialaysis units | Thermo Fisher Scientific | 88401 | Slide-A-Lyzer mini dialysis units |
| Centrifugal filter units, 100kDa MWCO | EMD Millipore | UFC5100008 | Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane |
| Detergent absorbing beads | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 1523920 | Bio-bead SM-2 absorbants |
| SYBR Green II | Thermo Fisher Scientific | S-7564 | Flourescent dye for nucleic acid staining, when detecting with SYPRO Ruby present, use excitation wavelength of 488 nm and emission wavelength of 532 nm |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S-12000 | Flourescent dye for protein staining, when detecting with SYBR Green II present, use excitation wavelength of 457 nm and emission wavelength of 670 nm |
| Copper grids | Electron Microscopy Sciences | G400-CP |
Riferimenti
- Gavin, A. C., et al. Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes. Nature. 415 (6868), 141-147 (2002).
- Rigaut, G., Shevchenko, A., Rutz, B., Wilm, M., Mann, M., Seraphin, B. A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration. Nature Biotechnology. 17 (10), 1030-1032 (1999).
- Puig, O., et al. The tandem affinity purification (TAP) method: A general procedure of protein complex purification. Methods. 24 (3), 218-229 (2001).
- Vaillancourt, P., Zheng, C. F., Hoang, D. Q., Breister, L. Affinity purification of recombinant proteins fused to calmodulin or to calmodulin-binding peptides. Methods Enzymol. 326, 340-362 (2000).
- Braisted, A. C., Wells, J. A. Minimizing a binding domain from protein A. Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (12), 5688-5692 (1996).
- Kapust, R. B., et al. Tobacco etch virus protease: mechanism of autolysis and rational design of stable mutants with wild-type catalytic proficiency. Protein Eng. 14 (12), 993-1000 (2001).
- Nallamsetty, S., et al. Efficient site-specific processing of fusion proteins by tobacco vein mottling virus protease in vivo and in vitro. Protein Expr Purif. 38 (1), 108-115 (2004).
- Ghaemmaghami, S., et al. Global analysis of protein expression in yeast. Nature. 425 (6959), 737-741 (2003).
- Howson, R., et al. Construction, verification and experimental use of two epitope-tagged collections of budding yeast strains. Comp Funct Genomics. 6 (1-2), 2-16 (2005).
- Cox, D. M., Du, M., Guo, X., Siu, K. W., McDermott, J. C. Tandem affinity purification of protein complexes from mammalian cells. Biotechniques. 33 (2), 267-268 (2002).
- Gully, D., Moinier, D., Loiseau, L., Bouveret, E. New partners of acyl carrier protein detected in Escherichia coli by tandem affinity purification. FEBS Lett. 548 (1-3), 90-96 (2003).
- Tharun, S. Purification and analysis of the decapping activator Lsm1p-7p-Pat1p complex from yeast. Methods Enzymol. 448, 41-55 (2008).
- Xu, X., Song, Y., Li, Y., Chang, J., Zhang, H., An, L. The tandem affinity purification method: an efficient system for protein complex purification and protein interaction identification. Protein Expr Purif. 72 (2), 149-156 (2010).
- Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. A Primer to Single-Particle Cryo-Electron Microscopy. Cell. 161 (3), 438-449 (2015).
- Gottschalk, A., et al. A comprehensive biochemical and genetic analysis of the yeast U1 snRNP reveals five novel proteins. RNA. 4 (4), 374-393 (1998).
- Neubauer, G., Gottschalk, A., Fabrizio, P., Seraphin, B., Luhrmann, R., Mann, M. Identification of the proteins of the yeast U1 small nuclear ribonucleoprotein complex by mass spectrometry. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (2), 385-390 (1997).
- Lucast, L. J., Batey, R. T., Doudna, J. A. Large-scale purification of a stable form of recombinant tobacco etch virus protease. Biotechniques. 30 (3), 544-546 (2001).
