Monstervoorbereiding Mass Cytometry Analysis
Summary
This article describes the collection and processing of samples for mass cytometry analysis.
Abstract
Massa gebruikt cytometrie antilichamen geconjugeerd met zware metalen labels, een benadering die sterk het aantal parameters en mogelijkheden voor diepgaande analyse vormt dan mogelijk is met conventionele fluorescentie gebaseerde stroomcytometrie is toegenomen. Zoals met elke nieuwe technologie, zijn er kritische stappen die bijdragen aan een betrouwbare generatie van kwalitatief hoogwaardige data. Hier voorgesteld is een geoptimaliseerd protocol dat meerdere technieken opneemt voor verwerking van celmonsters voor massa-cytometrie analyse. De hier beschreven methoden zal helpen de gebruiker voorkomende valkuilen te vermijden en het bereiken van consistente resultaten door het minimaliseren van variabiliteit, wat kan leiden tot onjuiste gegevens. Experimenteel ontwerp kennis, is de ratio optionele of alternatieve stappen in het protocol en de werkzaamheid bij het blootleggen van de kennis op de biologie van het systeem dat wordt onderzocht afgedekt. Ten slotte is representatieve gegevens gepresenteerd om de verwachte resultaten van de technieken presente illustrerenHier d.
Introduction
Cytometrie maakt de gelijktijdige meting van verschillende antilichaam doelen op een enkele cel niveau in grote populaties van cellen. In traditionele fluorescentie gebaseerde doorstroomcytometrie, wordt het aantal parameters dat kan worden gekwantificeerd beperkt door spectrale overlap tussen het emissiespectrum van meerdere fluoroforen, die steeds complexer compensatieberekeningen als het aantal parameters toeneemt vereist. Deze beperkingen worden aangepakt massa cytometrie, waarbij heavy metal-geconjugeerde antilichamen gedetecteerd en gekwantificeerd vluchttijd (TOF) massaspectrometrie om het aantal parameters gelijktijdig verzamelde sterk worden vergroot en op een hoge dimensionele eiwit-overvloed profiel van elke individuele cel.
Een fundamenteel begrip van de werking van de massa cytometrie instrument is gunstig voor de gebruiker en kan essentieel zijn voor het oplossen van problemen. Voor een meer gedetailleerde beschrijving van tuning en het runnen van een massa cytometrie machine,Zie het verwante manuscript 1. In het kort wordt een celmonster gelabeld met een panel van metaal geconjugeerde antilichamen gericht celoppervlak markers, cytoplasmische eiwitten, kerneiwitten, chromatine-gebonden eiwitten of andere epitopen van belang (figuur 1i). De gelabelde cellen worden geladen op de machine, hetzij een voor een handmatig injectie of via een autosampler dat monsters van een 96-wells plaat. De geladen cellen worden geïnjecteerd via een vernevelaar, waarbij een nevel van vloeistofdruppeltjes inkapselen van de cellen (figuur 1ii) genereert. Deze spray is gepositioneerd dat de cellen worden geïoniseerd door een argon plasmatoorts. Deze ionisatie genereert deeltjeswolk omvattende alle samenstellende atomen van elke cel (figuur 1iii). Aangezien deze deeltjeswolk reist naar de detector worden lage atoommassa atomen gescheiden van de hoge massa ionen door vierpool massa filter. De resterende hoge massa ionen blijft de detector, waarbij de abundance van elke isotoop gekwantificeerd (figuur 1iv). De ruwe gegevens verzameld door de detector, worden geanalyseerd door de massa cytometrie instrumentsoftware naar cel gebeurtenissen te identificeren. Voor elke geïdentificeerde cel geval wordt de in elk kanaalsignaal gekwantificeerd en opgeslagen met een uitgang .fcs bestand. De massa kanalen voor het opsporen van zware metalen geconjugeerde antilichamen vertonen een minimale spectrale overlap, dat varieert van 0-4% meeste bijdragen dan 1%. Vanwege deze lage overspraak tussen kanalen, het in het algemeen onnodig om de gegevens om te zetten met een compensatie voor de analyse matrix 2. Er moet echter bij het ontwerp van de experimentele panel van antilichamen worden gelet dat een antilichaam met hoogabondante epitoop niet is toegewezen aan een massa kanaal signaal bijdraagt aan een kanaal toegewezen aan een laagabondante antilichaam, omdat dit maak een kunstmatig hoge populatie in het kanaal ontvangen van het signaal bijdrage.
<p class = "jove_content"> De exacte bereiding van monsters voor massa-cytometrie analyse is sterk afhankelijk van de soorten monsters verzameld en experimentele hypothese te testen. Wij voorbeelden van twee protocollen voor het oogsten van verschillende typen cellen (humane embryonale stamcellen) en primaire cellen (muis borsttumor epitheelcel isolaat). Bij het begin van een massa cytometrie studie, is het raadzaam om eerst het uitvoeren van een kleine pilot experiment dat alle protocollen en antilichamen worden gebruikt functioneren goed in handen van de onderzoeker. Dit is in het bijzonder essentieel wanneer aangepaste geconjugeerde antilichamen te gebruiken als gedeeltelijke reductiereactie gedurende de antilichaamconjugatie heeft het potentieel om antilichaamaffiniteit verstoren; derhalve elke aangepaste antilichaam moet empirisch gevalideerd om nauwkeurig gegevens. Andere overwegingen omvatten het bepalen of celoppervlak antilichamen in de assay te gebruiken hun epitopen herkennen na fixatie of als ze need moet worden toegepast op levende cellen. Bepaalde fixatie kunnen goede kleuring te voorkomen met celoppervlak antilichamen zoals bekend zijn voor peptide-MHC kleuring 3, 4. Uitvoeren celoppervlak antilichaam kleuring van levende cellen noodzakelijk zijn voor sommige antilichamen, maar de mogelijkheid uitsluit barcodes vóór antilichaammerking de meeste barcodes werkwijzen worden uitgevoerd na fixatie 5 hoewel antilichaam gebaseerde barcoding 6, 7 is een uitzondering.De bepaling van het aantal cellen te bereiden voor analyse, is het belangrijk te weten dat slechts een fractie van de cellen op het apparaat geladen wordt gedetecteerd en te produceren. Dit verlies is vooral te wijten aan inefficiëntie wanneer de vernevelaar sprays het monster bij de toorts. Het exacte percentage verlies is afhankelijk van de massa cytometrie machine setup en celtype, maar kan variëren van 50-85% bedraagt en moet wordenoverwogen bij het ontwerpen van het experiment. Dit protocol is geoptimaliseerd voor 2×10 6 cellen per monster, maar kan worden aangepast voor het verwerken van kleinere of grotere steekproefomvang. Dit protocol kan worden gebruikt met minimale wijzigingen voor steekproefomvang van 1 x 06-04 oktober x 10 6, maar het is essentieel dat steekproefomvang overeenstemming binnen een experiment worden bewaard. Veranderingen in celaantal kan invloed hebben op de intensiteit van barcodes en antilichaamkleuring en ruwweg overeen worden bewaard in monsters direct te vergelijken.
Sommige procedures, zoals dode cellen en labeling DNA labeling dient in de overgrote meerderheid uitgevoerd, zoniet allemaal proefopzetten. De etikettering van dode cellen in experimenten analyse alleen oppervlaktemerkers kan worden bereikt met behulp Rh103, maar Rh103, te vermijden voor experimenten waarbij permeabilisatie nodig omdat het resulteert in kleuring verlies. Voor experimenten met permeabilisatie, is het raadzaam om cisplatine gebruiken <sup class = "xref"> 8 en, indien mogelijk, een antilichaam dat gesplitst PARP of gesplitst caspase apoptotische en dode cellen te detecteren.
Barcodes monsters kan verminderen consumptie antilichaam acquisitietijd verminderen en elimineren van monster tot monster variabiliteit 9. De werkwijze omvat het aanbrengen van barcodes unique sample-specifieke code voor alle cellen, die wordt gebruikt om elke cel toe te wijzen aan het monster van herkomst. Na barcodes de monsters vóór antilichaamkleuring, een proces waarbij alle monsters zijn gelijk gekleurd worden samengevoegd. Experimentele fouten te minimaliseren, is het verstandig om barcode en alle monsters die rechtstreeks worden vergeleken met elkaar bundelen. Momenteel bestaan er verschillende werkwijzen voor barcodes monsters voor massa-cytometrie analyse 5, 6, 7, waarvan er twee worden hier gepresenteerd (zie hieronder).
Met de huidige beschikbare Reagents is het mogelijk om de overvloed van 38 antilichaamdoelen kwantificeren, te identificeren cellen in S-fase 10 onderscheiden levende en dode cellen 8 en meet cellulaire niveaus van hypoxie 11 in een gemultiplexte experiment meerdere monsters. Dit vermogen om hoge parameter eencellige verzamelen van grote celpopulaties maakt verbeterde profilering zeer heterogene celpopulaties en heeft reeds een aantal nieuwe biologische inzichten 12, 13, 14, 15, 16 gevormd. Het destilleren van de resulterende complexe gegevens interpreteerbaar is het gebruik van algoritmes zoals spanning tree progressie van Density genormaliseerde Events (SPADE) 17 en viSNE 18 vereist.
Dit artikel presenteert een toegankelijkeoverzicht van hoe het ontwerpen en uitvoeren van een massa cytometrie experiment en introduceert fundamentele analyse van de massa cytometrie data.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol hier gepresenteerde is met succes toegepast voor het verwerken van verschillende gekweekte cellijnen (H1 en H9 hESCs, mESCs, MCF7, HEK 293, KBM5, HMEC, MCF10a) en monsters primair weefsel (muisbeenmerg, muis embryonale lever, muis volwassen lever, muizentumor). Ongeacht de bron, elk weefsel dat kan worden gedissocieerd tot losse cellen met behoud van de cellulaire toestand vatbaar zijn voor analyse met massa- cytometrie moet zijn, maar kunnen een protocol optimalisatie vereisen. Het is belangrijk op te merk…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Work in the Barton lab was supported by a grant from the Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT RP110471). This research was supported in part, by a training grant fellowship for Ryan L. McCarthy from the National Institutes of Health Training Program in Molecular Genetics 5 T32 CA009299. The core facility that maintains and runs the mass cytometry machine is supported by CPRIT grant (RP121010) and NIH core grant (CA016672).
Materials
| mTeSR1 medium kit | Stem Cell technologies | 05850 | Warm at room temperature before use |
| DMEM F-12 | ThermoFisher | 11330-032 | Warm at 37°C before use |
| Accutase | Stem Cell technologies | 07920 | Warm at 37°C before use |
| Bovine serum albumin | Equitech | BAH62 | |
| phosphate buffered saline | Hyclone | SH30256.01 | |
| Saponin | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| Cell ID Pt194 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt195 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cell ID Pt196 | Fluidigm | Provided at 1mM | |
| Cisplatin | Enzo Life Sciences | ALX-400-040-M250 | Soluble to 25mg/ml in DMSO |
| Cell-ID 20-plex Pd Barcoding Kit | Fluidigm | 201060 | |
| 5-Iodo-2'-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | I7125 | Soluble to 74mg/ml in 0.2N NaOH |
| Rhodium 103 intercelating agent | Fluidigm | 201103A | |
| Methanol | Fisher | BP1105-4 | Chill at -20°C before use |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| 5ml round bottom tubes | Falcon | 352058 | |
| 5ml 35um filter cap tubes | Falcon | 352235 | |
| EQ four element calibration beads | Fluidigm | 201078 | |
| Hyaluronidase Type I-S | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| Disposable Scalpel #10 | Sigma-Aldrich | Z69239 |
Riferimenti
- Leipold, M. D., Maecker, H. T. Mass cytometry: protocol for daily tuning and running cell samples on a CyTOF mass cytometer. J Vis Exp. , e4398 (2012).
- Leipold, M. D. Another step on the path to mass cytometry standardization. Cytometry A. 87, 380-382 (2015).
- Newell, E. W., et al. Combinatorial tetramer staining and mass cytometry analysis facilitate T-cell epitope mapping and characterization. Nat Biotechnol. 31, 623-629 (2013).
- Leong, M. L., Newell, E. W. Multiplexed Peptide-MHC Tetramer Staining with Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 115-131 (2015).
- Zunder, E. R., et al. Palladium-based mass tag cell barcoding with a doublet-filtering scheme and single-cell deconvolution algorithm. Nat Protoc. 10, 316-333 (2015).
- Lai, L., Ong, R., Li, J., Albani, S. A CD45-based barcoding approach to multiplex mass-cytometry (CyTOF). Cytometry A. 87, 369-374 (2015).
- Mei, H. E., Leipold, M. D., Schulz, A. R., Chester, C., Maecker, H. T. Barcoding of live human peripheral blood mononuclear cells for multiplexed mass cytometry. J Immunol. 194, 2022-2031 (2015).
- Fienberg, H. G., Simonds, E. F., Fantl, W. J., Nolan, G. P., Bodenmiller, B. A platinum-based covalent viability reagent for single-cell mass cytometry. Cytometry A. 81, 467-475 (2012).
- Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Fluorescent cell barcoding in flow cytometry allows high-throughput drug screening and signaling profiling. Nat Methods. 3, 361-368 (2006).
- Behbehani, G. K., Bendall, S. C., Clutter, M. R., Fantl, W. J., Nolan, G. P. Single-cell mass cytometry adapted to measurements of the cell cycle. Cytometry A. 81, 552-566 (2012).
- Edgar, L. J., et al. Identification of hypoxic cells using an organotellurium tag compatible with mass cytometry. Angew Chem Int Ed Engl. 53, 11473-11477 (2014).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332, 687-696 (2011).
- Horowitz, A., et al. Genetic and environmental determinants of human NK cell diversity revealed by mass cytometry. Sci Transl Med. 5, 208ra145 (2013).
- Zunder, E. R., Lujan, E., Goltsev, Y., Wernig, M., Nolan, G. P. A continuous molecular roadmap to iPSC reprogramming through progression analysis of single-cell mass cytometry. Cell Stem Cell. 16, 323-337 (2015).
- Han, L., et al. Single-cell mass cytometry reveals intracellular survival/proliferative signaling in FLT3-ITD-mutated AML stem/progenitor cells. Cytometry A. 87, 346-356 (2015).
- Bendall, S. C., et al. Single-cell trajectory detection uncovers progression and regulatory coordination in human B cell development. Cell. 157, 714-725 (2014).
- Qiu, P., et al. Extracting a cellular hierarchy from high-dimensional cytometry data with SPADE. Nat Biotechnol. 29, 886-891 (2011).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31, 545-552 (2013).
- Behbehani, G. K., et al. Transient partial permeabilization with saponin enables cellular barcoding prior to surface marker staining. Cytometry A. 85, 1011-1019 (2014).
- Finck, R., et al. Normalization of mass cytometry data with bead standards. Cytometry A. 83, 483-494 (2013).
- Chester, C., Maecker, H. T. Algorithmic Tools for Mining High-Dimensional Cytometry Data. J Immunol. 195, 773-779 (2015).
- Diggins, K. E., Ferrell, P. B., Irish, J. M. Methods for discovery and characterization of cell subsets in high dimensional mass cytometry data. Methods. 82, 55-63 (2015).
- Leelatian, N., Diggins, K. E., Irish, J. M. Characterizing Phenotypes and Signaling Networks of Single Human Cells by Mass Cytometry. Methods Mol Biol. 1346, 99-113 (2015).
- van der Maaten, L. J. P., Hinton, G. E. Visualizaing Data using t-SNE. J. Mach. Learn. Res. 9, 2431-2456 (2008).
- Kling, J. Cytometry: Measure for measure. Nature. 518, 439-443 (2015).
- Gregori, G., et al. Hyperspectral cytometry. Curr Top Microbiol Immunol. 377, 191-210 (2014).
- Chattopadhyay, P. K., et al. Brilliant violet fluorophores: a new class of ultrabright fluorescent compounds for immunofluorescence experiments. Cytometry A. 81, 456-466 (2012).
- Rieger, A. M., Havixbeck, J. J., Barreda, D. R. X-FISH: Analysis of cellular RNA expression patterns using flow cytometry. J Immunol Methods. 423, 111-119 (2015).
- Frei, A. P., et al. Highly multiplexed simultaneous detection of RNAs and proteins in single cells. Nat Methods. 13, 269-275 (2016).
