Flödessortering och Exome-sekvensering av Reed-Sternberg-cellerna av klassisk Hodgkin-lymfom
Summary
Här beskriver vi ett kombinerat flödescytometriskt cellsorteringssystem och ett lågpresenterat, nästa generations bibliotekskonstruktionsprotokoll som är utformat för att producera högkvalitativa, hel-exome data från Hodgkin Reed-Sternberg (HRS) -cellerna av klassiskt Hodgkin-lymfom (CHL).
Abstract
Hodgkin Reed-Sternberg-cellerna av klassiskt Hodgkin-lymfom fördelas sparsamt inom en bakgrund av inflammatoriska lymfocyter och innefattar typiskt mindre än 1% av tumörmassan. Material som härrör från bulktumör innehåller tumörinnehåll vid en koncentration som inte är tillräcklig för karakterisering. Därför beskrivs fluorescensaktiverad cellsortering med användning av åtta antikroppar, såväl som sido- och framåtskridande, som ett förfarande för att snabbt separera och koncentrera sig med hög renhet tusentals HRS-celler från tumören för efterföljande studie. Samtidigt, eftersom standardprotokoll för exome-sekvensering vanligtvis kräver 100-1 000 ng ingångsd DNA, vilket ofta är för högt, även med flödessortering, tillhandahåller vi också ett optimerat bibliotek med låg ingångsbibliotek som kan producera högkvalitativ Data från så lite som 10 ng ingångsd DNA. Denna kombination kan producera nästa generations bibliotek som är lämpliga för hybridiseringsinspelning av hel-eXome beten eller mer fokuserade riktade paneler, efter önskemål. Exome-sekvensering av HRS-cellerna, jämfört med friska intratumor T- eller B-celler, kan identifiera somatiska förändringar, inklusive mutationer, insertioner och deletioner och kopieringstaländringar. Dessa resultat belyser molekylärbiologin hos HRS-celler och kan avslöja vägar för riktade läkemedelsbehandlingar.
Introduction
Framsteg i cancergenom som ett resultat av nästa generations sekvensering har lett till betydande genombrott vid identifieringen av terapeutiska mål och i prognostikering för många hematologiska och icke-hematologiska neoplasmer. Nya individuella behandlingsstrategier baserade på specifika genomförändringar introduceras snabbt i många tumortyper (ses i referenser 1 , 2 ). Trots betydande framsteg i lymfom genomik hade genomet hos neoplastiska HRS-celler i klassiskt Hodgkin-lymfom (CHL) undersökts. Undersökningarna har hindrats av brist på neoplastiska HRS-celler inom en reaktiv mikromiljö, vilket gör det svårt att isolera renade HRS-cellpopulationer 3 .
Metoden för isolering av livskraftiga HRS-celler från primära tumörer utvecklades av Fromm et al. 4 ,Ref "> 5 , 6. Metoden använder en åtta antikroppscocktail, bestående av CD30, CD15, CD40, CD95, CD45 CD20, CD5 och CD64 för att entydigt identifiera HRS-celler från en CHL-tumorsuspension. Kan isolera minst 1000 livskraftiga HRS-celler från friska eller frysta cellsuspensioner från tumörbiopsier som består av minst 10 7 celler (cirka 10 mg vävnad). Renheten är större än 90% genom flödescytometrisk analys och uppskattas vara Minst 80% genom genom-genom-analys av tio på varandra följande fall.
Vi har förfinat en flödescytometrisk cellisoleringsteknik som kraftigt underlättat processen, vilket möjliggör snabb isolering av tusentals livskraftiga HRS-celler från primära CHL-tumörer 7 . Vi har använt tekniken för att producera vad som anses vara den första hel-exom-sekvensen av tumörcellerna i primära fall av Hodgkin-lymfom. Våra studier visar attE genomförbarhet av hög genomströmning genom genomgående studier av enskilda CHL-fall och har redan lett till identifiering av nya genomiska förändringar med potential att förklara aspekter av CHL-patogenes.
Vi vidareutvecklade en pipeline för att utnyttja det extraherade DNA-materialet för genom genomgångna genomströmningsstudier. För att uppnå tillförlitliga resultat från så få som 1000 sorterade HRS-celler (det minsta som erhölls från sekventiella fall) utvecklade vi vidare en modifierad nästa generations DNA-biblioteksbyggnadsprocedur 8 som gjorde det möjligt för oss att öka adapterligeringseffektiviteten och att generera DNA-fragmentbibliotek Utan överdriven amplifiering. Denna metod möjliggör analys av rutinmässiga kliniska prover och detektering av återkommande mutationer och kromosomala förändringar 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Framtida applikationer eller anvisningar efter att ha behärskat denna teknik
Detta arbete möjliggör exome-sekvensering från prover innehållande minst 10 ng DNA. I det kliniska sammanhanget utesluter denna gräns de flesta finna-aspirationsprover på grund av otillräckligt material, men det innefattar adekvata kärnbiopsier och excisionsbiopsiprover. Detta kommer att möjliggöra förvärv av data från en större uppsättning möjliga prover.
<p class="jove_content…Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Utvecklingen av denna projektmetod finansierades av Institutionen för patologi och laboratoriemedicin vid Weill Cornell Medical College. Vi erkänner det tri-institutionella utbildningsprogrammet i beräkningsbiologi och medicin för delfinansiering. Vi vill tacka forskarna som delade sin tid och sin kunskap med oss, särskilt Maryke Appel; Dan Burgess; Iwanka Kozarewa; Tchad Locklear; Och alla från Weill Cornell Medical College Genomics Core Facility, inklusive Jenny Zhang, Xiaobo (Shawn) Liang, Dong Xu, Wei Zhang, Huimin Shang, Tatiana Batson och Tuo Zhang.
Materials
| Petri or Cell Culture Dish (sterile) | |||
| RPMI-1640 Media | Roswell Park Memorial Institute | ||
| Fetal Calf Serum (FCS), (heat inactivated) | |||
| Freezing Media (RPMI, 20% FCS, 10% dimethylsulfoxide (DMSO))-make fresh and keep sterile | |||
| RPMI with 2% FCS (make fresh or store for up to 1 month) | |||
| scalpel with fresh blade | |||
| 10 ml syringe (no needle) | |||
| Cryogenic vials | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes, force | |||
| Centrifuge | capable of handling 50 ml conical centrifuge tubes and providing 400g | ||
| Hepes buffer(1M, cell culture grade) | |||
| phosphate buffered saline (PBS) | |||
| Pluoronic-F68 | Thermo-Fisher | 24040-032 | |
| DNAase-I | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | D4527-10KU | store as 5mg/ml in RPMI in -200C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | |||
| Sort Media (PBS+2%BSA+25mM HEPES+ Pluoronic –F68 (1X)) | |||
| CD64-FITC (22) | Beckman Coulter, Miami, FL | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD30-PE (BerH83) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD5-ECD (BL1a) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD40-PerCP-eFluor 710 (1C10) | Ebiosciences, San Diego, CA | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD20-PC7 (B9E9) | Beckman Coulter, Miami, FL | 10 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD15-APC (HI98) | BD Biosciences, San Jose, CA | 20 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD45 APC-H7 (2D1) | BD Biosciences, San Jose, CA | Can be substituted with 10 uL suggested volume of CD45-Krome Orange (J.33, Beckman Coulter); Titering is suggested | |
| CD95-Pacific Blue (DX2) | Life Technologies, Grand Island, NY | 5 uL suggested starting volume; Titering is suggested | |
| CD2 (5 μg; clone RPA-2.10) | Biolegend, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD54 (10 μg; clone 84H10) | Serotec, Oxford, United Kingdom | For optional protocol; Titering is suggested | |
| CD58 (10 μg; clone TS2/9) | eBioscience, San Diego, CA | For optional protocol; Titering is suggested | |
| LFA-1 (12 μg; clone MHM23) | Novus Biologicals, Littleton, CO | For optional protocol; Titering is suggested | |
| BD CS&T Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Accudrop Beads | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BC Versa Comp antibody capture beads | Beckman Coulter, Miami, FL | Compensation Beads | |
| BD-FACS ARIA special research order instrument using 5 lasers | BD Biosciences, San Jose, CA | any BD-FACS aria with capabilities to detect the fluorochromes in the antibody panel should be sufficient | |
| Wizard | Promega | A2360 | |
| 10 mM Tris-Cl buffer | NA | ||
| Qubit dsDNA HS Assay kit | Life Technologies, Carlsbad, CA | ||
| S2 Sonicator | Covaris, Woburn, MA | Alternatives may be substituted | |
| microTUBE | Covaris, Woburn, MA | ||
| Low-Throughput Library Preparation Kit | Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK8221 | |
| Sybr Green | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | S9430 | |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter, Miami, FL | ||
| Bioanalyzer | Agilent Technologies, Santa Clara, CA | ||
| SeqCap EZ Exome v.3.0 | Roche Nimblegen | 6465684001 | |
| HiSeq | Illumina | ||
| TruSeq-style Universal adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGAT*C*T | |
| TruSeq-style index adapter | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | HPLC purification; /5Phos/GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACNNNNNNATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG | |
| TruSeq-style PCR primer 1 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | AATGATACGGCGACCACCGAGA | |
| TruSeq-style PCR primer 2 | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | CAAGCAGAAGACGGCATACGAG | |
| Nuclease Free Duplex Buffer | Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville, Iowa | ||
| BD FACSDIVA software | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Falcon Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
| BD Flow Tubes | BD Biosciences, San Jose, CA | ||
Riferimenti
- Abrams, J. National Cancer Institute’s Precision Medicine Initiatives for the new National Clinical Trials Network. American Society of Clinical Oncology educational book / ASCO. American Society of Clinical Oncology. Meeting. , 71-76 (2014).
- Gagan, J., Van Allen, E. M. Next-generation sequencing to guide cancer therapy. Genome medicine. 7, 80 (2015).
- Matsuki, E., Younes, A. Lymphomagenesis in Hodgkin lymphoma. Seminars in cancer biology. 34, 14-21 (2015).
- Fromm, J. R., Kussick, S. J., Wood, B. L. Identification and purification of classical Hodgkin cells from lymph nodes by flow cytometry and flow cytometric cell sorting. Am J Clin Pathol. 126 (5), 764-780 (2006).
- Fromm, J. R., Thomas, A., Wood, B. L. Flow cytometry can diagnose classical hodgkin lymphoma in lymph nodes with high sensitivity and specificity. Am J Clin Pathol. 131 (3), 322-332 (2009).
- Roshal, M., Wood, B. L., Fromm, J. R. Flow cytometric detection of the classical hodgkin lymphoma: clinical and research applications. Advances in hematology. 2011, 387034 (2011).
- Reichel, J., et al. Flow sorting and exome sequencing reveal the oncogenome of primary Hodgkin and Reed-Sternberg cells. Blood. 125 (7), 1061-1072 (2015).
- Kozarewa, I. A Modified Method for Whole Exome Resequencing from Minimal Amounts of Starting DNA. PLoS ONE. 7 (3), e32617 (2012).
- Brunicardi, F. C. . Schwartz’s Principles of Surgery. , (2014).
- Kantor, A. B., Roederer, M. FACS analysis of leukocytes. Handbook of Experimental Immunology. 2, (1996).
- Sanders, M. E. Molecular pathways of adhesion in spontaneous rosetting of T-lymphocytes to the Hodgkin’s cell line L428. Cancer Res. 48 (1), 37-40 (1988).
- Biosciences. . FACSAria II User’s Guide. Part No. 644832, Revision A. , (2009).
- . Qubit 3.0 Fluorometer, Catalog Number Q33216 Available from: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33216 (2017)
- Roche Nimblegen. . SeqCap EZ Library SR User’s Guide ver. 4.1. , (2013).
- Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
- Li, H. The Sequence Alignment/Map format and SAMtools. Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).
- Saunders, C. T. Strelka: accurate somatic small-variant calling from sequenced tumor-normal sample pairs. Bioinformatics. 28 (14), 1811-1817 (2012).
- Cingolani, P., et al. A program for annotating and predicting the effects of single nucleotide polymorphisms, SnpEff: SNPs in the genome of Drosophila melanogaster strain w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 6 (2), 80-92 (2012).
- Dobin, A. STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).
- Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
- . DNA copy number data analysis. v.R package version 1.34.0 Available from: https://omictools.com/dnacopy-tool (2013)
