CUBIC Protocol Visualiseert Protein Expression op enkel cel resolutie in Whole Mount Skin Voorbereidingen
Summary
Dit rapport beschrijft een KUBIEKE protocol om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen, delende cellen, en sebocyten bij de enkele resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen.
Abstract
De huid is essentieel voor overleving. De buitenste epidermale laag bestaat uit de interfolliculaire epidermis, wat een meerlagig plaveiselepitheel die het grootste deel van ons lichaam en epidermale aanhangsels zoals de haarfollikels en zweetklieren. De epidermis ondergaat regeneratie gedurende het hele leven en in reactie op letsel. Dit wordt mogelijk gemaakt door K14 expressie basale epidermale stamcellen / voorlopercellen cel populaties die strak worden gereguleerd door meerdere regulerende mechanismen actief binnen de epidermis en tussen de opperhuid en de lederhuid. Dit artikel beschrijft een eenvoudige methode om de volledige dikte muis huid biopten te verduidelijken en te visualiseren K14 eiwit expressie patronen, Ki67 gelabeld delende cellen, Nile Red label sebocyten en DAPI nucleaire etikettering op één resolutie cel in 3D. Deze methode maakt een nauwkeurige evaluatie en kwantificering van de huid anatomie en pathologie, en abnormale epidermale fenotypes in genetisch gemodificeerde muis lijnen. De CUBIC protocol is the best beschikbare methode tot op heden de moleculaire en cellulaire interacties in de volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel te onderzoeken.
Introduction
De huid is essentieel voor overleving. Het bestaat uit drie lagen van de buitenste epidermis, de dermis en de hypodermis. De epidermis is een zeer regeneratief weefsel. Het is een geschubde gelaagd epitheel, bestaat voornamelijk uit keratinocyten. Keratinocyten worden geboren in de basale laag, en omhoog bewegen door de suprabasale lagen terwijl differentiëren, en ze uiteindelijk worden afgeworpen in de buitenste laag verhoornde ongeveer een maand na hun geboorte. De epidermis ontwikkelt een aantal aanhangsels waaronder de haarfollikels en talgklieren. De haarzakjes ook regenereren op een cyclische manier gedurende het hele leven 1. De regeneratieve capaciteit van de epidermis wordt mogelijk gemaakt door de aanwezigheid van stamcellen en cellen die zich bevinden in de basale laag van de epidermis en interfolliculaire haarfollikel 2.
Veel signaalroutes zijn betrokken bij epidermale ontwikkeling en regeneratie. Sommige van deze optreden binnenalleen de epidermis, zoals de Hedgehog pathway. Andere signalering evenementen plaats tussen dermis en epidermis 3. Zo worden Wnt signalen van de dermis belangrijk geacht voor haarfollikel ontwikkeling, en ze worden uitgescheiden door de dermale papilla bij het begin van anagen activeren haarfollikel uitstulping stam / voorlopercellen celproliferatie en haarzakje groei 4. Het is belangrijk om de cellulaire en moleculaire mechanismen die epidermale ontwikkeling en regeneratie controle beter te begrijpen hoe ze regeneratieve huidziekte kan worden verstoord zoals huidkanker begrijpen.
Dit artikel beschrijft een C Lear, U nobstructed B regen I maging cocktails en C omputational analyse (KUBIEKE) protocol 5-7 op hele berg voorbereidingen huid te verduidelijken en te visualiseren eiwit expressie patronen in 3 dimensies op één resolutie cel door confocale microscopie. De KUBIEKE methode houdt onderdompelen van de huidweefsel in twee-aminoalcohol gebaseerde chemische cocktails. Deze oplossingen stellen de brekingsindex in de huid monster, waardoor het weefsel transparante en de eiwitten intact, waardoor immunodetectie op enkele resolutie cel.
Gebruik van deze CUBIC protocol, de basale prolifererende keratinocyten in de populaties interfolliculaire epidermis en in haarfollikels werden afgebeeld in volledige dikte huid biopten van wildtype muizen met behulp van anti-Keratin14 (K14) en anti-Ki67-antilichamen. Talgklieren in wild-type huid biopten werden ook gevisualiseerd met behulp van Nile Red kleuring. Ten slotte is de basale keratinocyten bevolking in wild-type en hyperplastische YAP2-5SA-ΔC huid biopsieën werden vergeleken 8.
Dit CUBIC protocol maakt visuele beoordeling van eiwitexpressie in volledige dikte van de huid biopsieën bij enkele resolutie cel, en is een belangrijk instrument om epidermale anatomie en morfologische gebreken in de huid van genetisch gemodificeerde waarderenmuizen, en de cellulaire en moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen epidermale ontwikkeling en regeneratie te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
De regulerende mechanismen die de ontwikkeling en homeostase huid worden meestal bestudeerd in 2D behulp van weefsel snijden en histologische kleuring of merken met antilichamen, die slechts een beperkte appreciatie huid morfologie, celpopulaties of eiwitexpressie mogelijk maakt. Een aantal werkwijzen zijn ontwikkeld om visualisatie van de ruimtelijke organisatie van cellen en eiwitten op één resolutiecel verbeteren 3 dimensies epidermale whole mounts 10-13. Sommige van deze echter gescheiden van de epiderm…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Australische Bio-Resources (Garvan Institute, Australië), de biologische rijkdommen Centre (UNSW Australië) en de Animal Care & Ethische Commissie voor ondersteuning bij dierproeven. Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales is ontvangers van een CONICYT-Becas Chile beurs (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios is een ontvanger van de Universiteit International Postgraduate Award van UNSW Australië.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Riferimenti
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
