CUBIC protokol Visualiserer Protein Expression på Single Cell Opløsning i Whole Mount Skin Forberedelser
Summary
Denne rapport beskriver en CUBIC protokol at afklare fuld tykkelse mus hud biopsier, og visualisere protein ekspressionsmønstre, prolifererende celler og sebocytter på enkelt celle opløsning i 3D. Denne metode giver nøjagtig vurdering af hudens anatomi og patologi, og af unormale epidermale fænotyper i genetisk modificerede mus linjer.
Abstract
Huden er afgørende for vores overlevelse. Det ydre epidermale lag består af interfollicular epidermis, hvilket er en stratificeret pladeepitel dækker det meste af vores krop, og epidermale vedhæng såsom hårsækkene og svedkirtler. Epidermis undergår regenerering hele livet og som svar på skade. Dette er aktiveret af K14-udtrykkende basale epidermale stamceller / stamceller populationer, der er tæt reguleret af flere reguleringsmekanismer aktive inden overhuden og mellem epidermis og dermis. Denne artikel beskriver en enkel metode til at afklare fuld tykkelse mus hud biopsier, og visualisere K14 protein ekspressionsmønstre, Ki67 mærket prolifererende celler, Nile Red mærkede sebocytter, og DAPI nukleare mærkning på enkelt celle opløsning i 3D. Denne metode giver nøjagtig vurdering og kvantificering af hudens anatomi og patologi, og af unormale epidermale fænotyper i genetisk modificerede mus linjer. CUBIC protokollen er the bedste metode til rådighed til dato for at undersøge molekylære og cellulære interaktioner i fuld tykkelse hud biopsier på enkelt celle opløsning.
Introduction
Huden er afgørende for vores overlevelse. Det består af tre hovedlag de ydre epidermis, dermis og hypodermis. Epidermis er en meget regenerativ væv. Det er en skællede stratificeret epitel, består hovedsagelig af keratinocytter. Keratinocytter er født i det basale lag, og bevæger sig opad gennem suprabasallagene mens differentiere, og i sidste ende de er udgydt i det ydre forhornede lag omkring en måned efter deres fødsel. Epidermis udvikler en række af vedhæng herunder hårsækkene og talgkirtler. De hårsækkene også regenerere i en cyklisk måde gennem hele livet en. Regenereringsevne af epidermis er aktiveret ved tilstedeværelsen af stamceller og progenitorceller, der er placeret i det basale lag af epidermis og interfollicular hårsækken 2.
Mange signalveje er blevet impliceret i epidermal udvikling og regeneration. Nogle af disse forekommer indenkun epidermis, såsom pindsvineoverføringsvejen. Andre signalering begivenheder finder sted mellem dermis og epidermis 3. For eksempel er Wnt signaler fra dermis menes at være vigtigt for hårsækken udvikling, og de udskilles af den dermale papil ved begyndelsen af anagen at aktivere hårsækken bule stamceller / progenitor celleproliferation og hårsækken vækst 4. Det er vigtigt at forstå de cellulære og molekylære mekanismer, der styrer epidermal udvikling og regeneration for bedre at forstå, hvordan de kan forstyrres i regenerativ hudsygdom såsom hudkræft.
Denne artikel beskriver en C lear, U nobstructed B regn I maging cocktails og C omputational analyse (CUBIC) protokol 5-7 for at afklare hele mount hud præparater, og visualisere protein ekspressionsmønstre i 3 dimensioner ved enkelt celle beslutning konfokal mikroskopi. CUBIC metode indebærer nedsænkning af hudenvæv i to aminoalkohol-baserede kemiske cocktails. Disse løsninger justere brydningsindekserne i huden prøven, hvorefter vævet gennemsigtig og proteinerne intakt, så immunodetektion på enkelt celle opløsning.
Brug af denne CUBIC protokol, den basale og prolifererende keratinocytter populationer i interfollicular epidermis og i hårsækken blev afbildet i fuld tykkelse hud biopsier af vildtypemus anvendelse af anti-Keratin14 (K14) og anti-Ki67-antistoffer. Talgkirtlerne i vildtype hudbiopsier blev også visualiseret under anvendelse Nile Red-farvning. Endelig blev de basale keratinocytter befolkninger i vildtype og hyperplastiske YAP2-5SA-ΔC hud biopsier sammenlignet 8.
Denne CUBIC protokol muliggør visuel vurdering af protein-ekspression i fuld tykkelse hud biopsier på enkelt celle opløsning, og er et vigtigt redskab til at sætte pris på epidermal anatomi og morfologiske defekter i huden af genetisk modificeredemus, og til at undersøge de cellulære og molekylære mekanismer bag epidermal udvikling og regeneration.
Protocol
Representative Results
Discussion
De regulatoriske mekanismer, der styrer hud udvikling og homeostase er mest almindeligt undersøgt i 2D ved hjælp af væv sektionering og histologisk farvning eller mærkning med antistoffer, som gør det muligt kun en begrænset forståelse af huden morfologi, cellepopulationer eller protein udtryk. Et antal fremgangsmåder er blevet udviklet for at forbedre visualisering af den rumlige organisation af celler og proteiner ved enkelt celle opløsning i 3 dimensioner i epidermale hele underlag 10-13. Nogle af…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Australian Bio-Ressourcer (Garvan Institute, Australien), den biologiske ressourcer Centre (UNSW Australien) og Animal Care & etiske komité for støtte med dyreforsøg. Dette arbejde blev støttet af National Health og Medical Research Council of Australia (Project Grant APP1062720). Dr. Cesar P. Canales er modtagere af en CONICYT-Becas Chile stipendium (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios er en modtager af University International Postgraduate Award af UNSW Australien.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Riferimenti
- Fuchs, E. Scratching the surface of skin development. Nature. 445 (7130), 834-842 (2007).
- Watt, F. M., Lo Celso, C., Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr Opin Genet Dev. 16 (5), 518-524 (2006).
- Hardy, M. H. The secret life of the hair follicle. Trends Genet. 8 (2), 55-61 (1992).
- Lim, X., Nusse, R. Wnt signaling in skin development, homeostasis, and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (2), (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Susaki, E. A., Tainaka, K., Perrin, D., Yukinaga, H., Kuno, A., Ueda, H. R. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nat Protoc. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Beverdam, A., Claxton, C., Zhang, X., James, G., Harvey, K. F., Key, B. Yap controls stem/progenitor cell proliferation in the mouse postnatal epidermis. J Invest Dermatol. 133 (6), 1497-1505 (2013).
- Fuchs, E., Green, H. Changes in keratin gene expression during terminal differentiation of the keratinocyte. Cell. 19 (4), 1033-1042 (1980).
- Braun, K. M., Niemann, C., Jensen, U. B., Sundberg, J. P., Silva-Vargas, V., Watt, F. M. Manipulation of stem cell proliferation and lineage commitment: visualisation of label-retaining cells in wholemounts of mouse epidermis. Development. 130 (21), 5241-5255 (2003).
- Hamilton, E., Potten, C. S. Influence of hair plucking on the turnover time of the epidermal basal layer. Cell Tissue Kinet. 5 (6), 505-517 (1972).
- Morris, R. J., Fischer, S. M., Slaga, T. J. Evidence that a slowly cycling subpopulation of adult murine epidermal cells retains carcinogen. Cancer Res. 46 (6), 3061-3066 (1986).
- Schweizer, J., Marks, F. A developmental study of the distribution and frequency of Langerhans cells in relation to formation of patterning in mouse tail epidermis. J Invest Dermatol. 69 (2), 198-204 (1977).
- Chang, H., Wang, Y., Wu, H., Nathans, J. Flat mount imaging of mouse skin and its application to the analysis of hair follicle patterning and sensory axon morphology. J Vis Exp. (88), e51749 (2014).
