CUBIC Protokoll Visualisiert Expression Protein bei Single Cell Resolution in Ganze Berge Vorbereitung der Haut
Summary
Dieser Bericht beschreibt ein kubischer Protokoll voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und Proteinexpressionsmuster, wuchernden Zellen und Sebozyten auf Einzelzell Auflösung in 3D visualisieren. Diese Methode ermöglicht eine genaue Beurteilung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien.
Abstract
Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Die äußere Schicht der Epidermis besteht aus den interfollikulären Epidermis, die eine geschichtete Plattenepithel ist die meisten unserer Körper abdeckt und epidermalen Anhangs wie die Haarfollikel und Schweißdrüsen. Die Epidermis erfährt Regeneration während des Lebens und in Reaktion auf eine Verletzung. Dies wird ermöglicht durch K14-exprimierenden basal epidermalen Stammzellen / Vorläuferzellpopulationen, die von mehreren Regulationsmechanismen streng reguliert werden aktiv in der Epidermis und zwischen Epidermis und Dermis. Dieser Artikel beschreibt eine einfache Methode, mit voller Dicke Maus Hautbiopsien zu klären und K14-Protein-Expressionsmuster visualisieren, Ki67 Zellen markiert wuchernden, Nile Red markierten Sebozyten und DAPI Kern Kennzeichnung auf Einzelzell Auflösung in 3D. Diese Methode ermöglicht eine genaue Bewertung und Quantifizierung der Haut Anatomie und Pathologie und abnormer epidermalen Phänotypen in genetisch veränderten Mauslinien. Das CUBIC-Protokoll ist the beste Methode bisher verfügbaren molekularen und zellulären Wechselwirkungen in Vollhautbiopsien bei einzelnen Zelle Auflösung zu untersuchen.
Introduction
Die Haut ist wichtig für unser Überleben. Es besteht aus drei Hauptschichten die äußeren Epidermis, die Dermis und die Hypodermis. Die Epidermis ist ein hoch regenerative Gewebe. Es ist ein Plattenepithelkarzinom geschichteten Epithels, bestehend hauptsächlich aus Keratinozyten. Keratinozyten sind in der basalen Schicht geboren und nach oben durch die Suprabasalschichten bewegen, während Differenzierung, und schließlich werden sie in der äußeren Hornschicht etwa einen Monat nach ihrer Geburt zu vergießen. Die Epidermis entsteht eine Reihe von Anhängsel einschließlich der Haarfollikel und Talgdrüsen. Die Haarfollikel regenerieren auch in einer zyklischen Art und Weise während des gesamten Lebens 1. Die regenerative Kapazität der Epidermis wird durch die Anwesenheit von Stamm- und Vorläuferzellen aktiviert , die in der Basalschicht der Epidermis und interfollikulären Haarfollikel 2 befinden.
Viele Signalwege wurden in epidermalen Entwicklung und Regeneration gebracht. Einige davon treten innerhalbdie Epidermis nur, wie das Hedgehog-Weg. Andere Signalereignisse stattfinden zwischen Dermis und Epidermis 3. Zum Beispiel Wnt – Signale von der Dermis sind gedacht für Haarfollikel – Entwicklung wichtig zu sein, und sie werden von der dermalen Papille zu Beginn der anagenen sekretiert Haarfollikel Ausbuchtung Stammzellen / Vorläuferzellproliferation und Haarfollikel Wachstum 4 aktivieren. Es ist wichtig, die zellulären und molekularen Mechanismen zu verstehen, die den epidermalen Entwicklung und Regeneration zu steuern, besser zu verstehen, wie sie in der regenerativen Hautkrankheit gestört werden kann, wie Hautkrebs.
Dieser Artikel beschreibt eine C lear, nobstructed U B regen I maging Cocktails und C omputational Analyse (kubisch) Protokoll 5-7 ganze Berg Hautpräparate zu klären und Proteinexpressionsmuster in drei Dimensionen auf Einzelzellauflösung durch konfokale Mikroskopie sichtbar zu machen. Die CUBIC Verfahren beinhaltet das Eintauchen HautGewebe in zwei Aminoalkohol-basierten chemischen Cocktails. Diese Lösungen stellen Sie die Brechungsindizes in der Hautprobe, so dass das Gewebe transparent und die Proteine intakt, so dass Immunnachweis auf Einzelzellauflösung.
Mit diesem CUBIC-Protokoll, die basale und wuchernden Keratinozyten-Populationen in den interfollikulären Epidermis und im Haarfollikel wurden in Vollhautbiopsien von Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von Anti-Keratin14 (K14) und Anti-Ki67-Antikörper abgebildet. Talgdrüsen in Wildtyp- Hautbiopsien wurden auch Färbung mit Nile Red sichtbar gemacht. Schließlich wurden 8 verglichen die basalen Keratinozyten – Populationen in Wildtyp- und hyperplastischem YAP2-5SA-& Delta; C Hautbiopsien.
Dieses CUBIC-Protokoll ermöglicht die visuelle Beurteilung der Proteinexpression in Vollhautbiopsien bei Einzelzellauflösung und ist ein wichtiges Instrument epidermalen Anatomie und morphologische Defekte in der Haut von gentechnisch veränderten zu schätzenMäuse und die zellulären und molekularen Mechanismen der epidermalen Entwicklung und Regeneration zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die regulatorischen Mechanismen steuern Haut Entwicklung und Homöostase werden am häufigsten in 2D untersucht unter Verwendung von Gewebe Schnitte und histologischen Färbung oder die Markierung mit Antikörpern, die nur eine eingeschränkte Anerkennung der Hautmorphologie, Zellpopulationen oder Proteinexpression ermöglicht. Eine Anzahl von Verfahren wurden die Visualisierung der räumlichen Organisation von Zellen und Proteinen an Einzelzellauflösung in 3 Dimensionen in epidermal ganze Halterungen 10-13 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken australischen Bio-Ressourcen (Garvan Institute, Australien), die biologische Ressourcen Centre (UNSW Australien) und der Animal Care & Ethik-Kommission für die Unterstützung bei Tierversuchen. Diese Arbeit wurde von der National Health and Medical Research Council of Australia (Projektstipendium APP1062720) unterstützt. Dr. Cesar P. Canales ist Empfänger eines CONICYT-Becas Chile Stipendium (# 72101076). Herr Bassem Akladios ist ein Empfänger der Universität International Postgraduate Award von UNSW Australien.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Riferimenti
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