Protocollo CUBIC Visualizza lo espressione della proteina a risoluzione singola cella di intere preparazioni della pelle Mount
Summary
Questo rapporto descrive un protocollo CUBIC per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare pattern di espressione delle proteine, le cellule proliferanti, e sebociti alla risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati.
Abstract
La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Lo strato epidermico esterno è costituito dell'epidermide interfollicolare, che è un epitelio squamoso stratificato che copre la maggior parte del nostro corpo, e appendici epidermiche, come i follicoli piliferi e delle ghiandole sudoripare. L'epidermide subisce rigenerazione per tutta la vita e in risposta al danno. Ciò è reso possibile dal K14-esprimendo popolazioni staminali / progenitrici di cellule basali epidermiche che sono strettamente regolati da molteplici meccanismi regolatori attivi all'interno dell'epidermide e tra epidermide e derma. Questo articolo descrive un metodo semplice per chiarire tutto spessore del mouse biopsie cutanee, e visualizzare modelli di espressione della proteina K14, Ki67 etichettato cellule proliferanti, Nile Red etichettato sebociti, e l'etichettatura nucleare DAPI ad una risoluzione di singola cellula in 3D. Questo metodo consente una valutazione accurata e la quantificazione di anatomia e patologia della pelle, e di fenotipi epidermiche anomali nelle linee di topi geneticamente modificati. Il protocollo è CUBIC °e miglior metodo disponibile ad oggi per indagare le interazioni molecolari e cellulari in piena biopsie cutanee spessore ad una risoluzione di singola cellula.
Introduction
La pelle è essenziale per la nostra sopravvivenza. Si compone di tre strati principali l'epidermide esterni, il derma e l'ipoderma. L'epidermide è un tessuto altamente rigenerativa. Si tratta di un epitelio stratificato squamoso, composta prevalentemente da cheratinociti. Cheratinociti sono nati nello strato basale, e si muovono verso l'alto attraverso gli strati soprabasali differenziando, e alla fine sono versate nello strato corneo esterno circa un mese dopo la loro nascita. L'epidermide sviluppa una serie di appendici compresi i follicoli piliferi e delle ghiandole sebacee. I follicoli piliferi rigenerano anche in modo ciclico per tutta la vita 1. La capacità rigenerativa dell'epidermide è consentito dalla presenza di cellule staminali e progenitrici che si trovano nello strato basale dell'epidermide interfollicolare e follicolo pilifero 2.
Molte vie di segnalazione sono stati implicati nello sviluppo epidermico e rigenerazione. Alcuni di questi si verificano all'internosolo l'epidermide, come il percorso Hedgehog. Altri eventi di segnalazione avvengono tra derma e dell'epidermide 3. Ad esempio, i segnali Wnt dal derma si pensa siano importanti per lo sviluppo del follicolo pilifero, e sono secreti dalla papilla dermica al momento della comparsa di anagen per attivare follicolo pilifero rigonfiamento la proliferazione delle cellule staminali / progenitrici e la crescita follicolo pilifero 4. E 'importante capire i meccanismi cellulari e molecolari che controllano lo sviluppo e la rigenerazione epidermica per capire meglio come essi possono essere disturbati in malattie della pelle rigenerativo come il cancro della pelle.
Questo articolo descrive un Lear C, U nobstructed B pioggia I cocktail Maging e analisi omputational (cubi) protocollo 5-7 C per chiarire interi preparati pelle di montaggio, e visualizzare modelli di espressione proteica in 3 dimensioni a risoluzione singola cellula al microscopio confocale. Il metodo CUBIC prevede l'immersione di pelletessuto in due cocktail chimici amminoalcol-based. Queste soluzioni regolare gli indici di rifrazione del campione di pelle, lasciando il tessuto trasparente e le proteine intatte, permettendo immunolocalizzazione con risoluzione di singola cellula.
Usando questo protocollo cubi, il basale e proliferanti popolazioni cheratinociti nell'epidermide interfollicolare e nel follicolo del capello sono stati ripreso in pieno biopsie cutanee spessore di tipo selvatico topo utilizzando anti-Keratin14 (K14) e anticorpi anti-Ki67. Le ghiandole sebacee in biopsie cutanee di tipo selvatico sono stati visualizzati con Nile Red colorazione. Infine, le popolazioni di cheratinociti basali di tipo selvatico e iperplastici biopsie cutanee YAP2-5SA-ΔC sono stati confrontati 8.
Questo protocollo permette CUBIC valutazione visiva di espressione della proteina in pieno biopsie cutanee spessore con risoluzione singola cella, ed è uno strumento importante per apprezzare l'anatomia epidermica e difetti morfologici nella pelle di organismi geneticamente modificatitopi, e di indagare i meccanismi cellulari e molecolari alla base dello sviluppo epidermico e la rigenerazione.
Protocol
Representative Results
Discussion
I meccanismi regolatori che controllano lo sviluppo della pelle e l'omeostasi sono più comunemente studiate in 2D utilizzando il sezionamento del tessuto e la colorazione istologica o l'etichettatura con anticorpi, che consente solo un apprezzamento limitato di morfologia della pelle, le popolazioni di cellule o di espressione della proteina. Sono stati sviluppati numerosi metodi per migliorare la visualizzazione della organizzazione spaziale delle cellule e proteine a risoluzione singola cellula in 3 dim…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo australiano Bio-Resources (Garvan Institute, Australia), il Centro di Risorse Biologiche (UNSW Australia) e la cura degli animali e del Comitato Etico per il supporto con la sperimentazione animale. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Health and Medical Research Council of Australia (sovvenzione di progetto APP1062720). Dr. Cesar P. Canales è destinatari di una borsa di studio CONICYT-Becas Cile (# 72.101.076). Mr. Bassem Akladios è un destinatario del Premio Internazionale dell'Università Postgraduate da UNSW Australia.
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Riferimenti
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