CUBICプロトコルは、全マウントスキン準備中の単一細胞の解像度でのタンパク質発現を可視化
Summary
このレポートは、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、3Dでの単一細胞の解像度でのタンパク質発現パターン、増殖細胞、および皮脂細胞を可視化するCUBICプロトコルについて説明します。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価を可能にします。
Abstract
皮膚は私たちの生存に必須です。外側の表皮層は、毛包と汗腺のように私たちの体、および表皮付属のほとんどをカバーする重層扁平上皮である毛包間表皮、から構成されています。表皮は、生涯を通じておよび傷害に応答して再生を受けます。これは、しっかりと、表皮内および表皮と真皮の間の積極的な複数の調節機構によって調節されているK14発現基底表皮幹細胞/前駆細胞集団で有効になっています。この記事では、全層マウスの皮膚生検を明らかにし、K14のタンパク質発現パターンを可視化するための簡単な方法を説明し、Ki67には増殖細胞を標識し、ナイルレッドは、3Dでの単一細胞の解像度で皮脂細胞、およびDAPI核の標識標識。この方法は、皮膚の解剖学や病理学の、遺伝子組み換えマウス系統の異常上皮表現型の正確な評価と定量化を可能にします。 CUBICプロトコルは番目です単一細胞の解像度で全層皮膚生検における分子と細胞の相互作用を調査する日付に利用可能な電子最良の方法。
Introduction
皮膚は私たちの生存に必須です。それは3つの主要な層の外側表皮、真皮および皮下組織で構成されています。表皮は非常に再生組織です。それは主にケラチノサイトからなる扁平重層上皮です。ケラチノサイトは基底層で生まれ、差別化しながら、基底上層を通って上方に移動し、最終的に彼らは彼らの出生後約一ヶ月外側角質層に流されているされています。表皮は、毛包や皮脂腺などの付属の数を開発しています。毛包はまた、人生1を通して循環方式で再生します。表皮の再生能力は、毛包間表皮と毛包2の基底層に位置している幹細胞および前駆細胞の存在によって有効になっています。
多くのシグナル伝達経路は、表皮の開発と再生に関与しています。これらのいくつかは、内に発生しますこのようなヘッジホッグ経路などの表皮のみ、。他のシグナル伝達事象は、真皮と表皮3との間で行われます。例えば、真皮からのWntシグナルは、毛包の発達のために重要であると考えられ、それらは毛包バルジ幹/前駆細胞の増殖および毛包の成長4を活性化する成長期の開始時に真皮乳頭によって分泌されます。より良い彼らは、皮膚癌などの再生皮膚病に撹乱することができる方法を理解するために、表皮の開発と再生を制御する細胞および分子メカニズムを理解することが重要です。
この記事では、Cのリアを説明し、Uは、 私はカクテルやC omputational分析全体の皮膚の準備をマウントし、共焦点顕微鏡により単一細胞の解像度で3次元でのタンパク質発現パターンを可視化明確にする（CUBIC）プロトコル5-7を maging Bの雨をnobstructed。キュービック法は、皮膚を浸漬することを含みます2アミノアルコールベースの化学カクテルで組織。これらのソリューションは、単一細胞の解像度で免疫検出を可能にする、透明およびタンパク質が無傷組織を残して、皮膚試料の屈折率を調整します。
このCUBICプロトコルを使用して、毛包間表皮および毛包における基礎および増殖性ケラチノサイト集団は完全な抗Keratin14を使用して、野生型マウスの厚さの皮膚生検（K14）および抗Ki67の抗体で画像化しました。野生型皮膚生検における皮脂腺も、ナイルレッド染色を用いて可視化しました。最後に、野生型および過形成YAP2-5SA-ΔCの皮膚生検における基底ケラチノサイト集団が8を比較しました。
このCUBICプロトコルは、単一細胞の解像度で全層皮膚生検におけるタンパク質発現の視覚的評価を可能にし、遺伝的に改変されたの皮膚における表皮解剖学と形態学的欠陥を理解する重要なツールですマウスは、表皮の発達と再生の基礎となる細胞および分子機構を調査します。
Protocol
Representative Results
Discussion
皮膚の発達および恒常性を制御する調節機構は、最も一般的には、皮膚の形態、細胞集団またはタンパク質発現の唯一の制限認識を可能にする、抗体を用いて組織切片、組織学的染色又はラベリングを用いて2次元で研究されています。多くの方法は、表皮全体マウント10-13で3次元的に単細胞解像度における細胞およびタンパク質の空間的組織の視覚化を改善するために開発されてき?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、動物実験でのサポートのためにオーストラリアのバイオ資源（ガーヴァン研究所、オーストラリア）、生物資源センター（UNSWオーストラリア）とアニマルケア＆倫理委員会に感謝します。この作品は、オーストラリア国立保健医療研究評議会（プロジェクト無償APP1062720）によってサポートされていました。博士セザールP.カナレスはCONICYT-Becasチリの奨学金（＃72101076）の受取人です。氏Bassem AkladiosはUNSWオーストラリアによって大学国際大学院賞を受賞です。
Materials
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6418 | |
| Ethanol 96% (undenaturated) | Chem-supply | UN1170 | |
| Nile Red | Sigma-Aldrich | 72485-100MG | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Roche | 10236276001 | |
| N,N,N’,N’-tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylenediamine | Merck Millipore | 821940 | |
| Polyethylene glycol mono-p-isooctylphenyl ether | Merck Millipore | 648462 | |
| Triton X-100 | Merck Millipore | 648462 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Optimal Cutting Temperature (OCT) Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| anti-Keratin14 antibody | Covance | PRB-155P | |
| anti-Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa 594 | Life Technologies | A21207 | |
| Dimethylsulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Urea | Merck Millipore | 66612 | |
| 2,2′,2′’-nitrilotriethanol | Merck Millipore | 137002 | |
| Confocal Microscope | Nikon Instruments Inc | Nikon A1 – Confocal Microscope | |
| cruZer6 Face Trimmer | Braun | Braun cruZer6 Face | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | 438456 |
Riferimenti
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